攪拌槽反應(yīng)器及方法
【專利說(shuō)明】攪拌槽反應(yīng)器及方法
[0001]本申請(qǐng)要求2008年12月16日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/201，865的優(yōu)先權(quán)，在此通過(guò)引用將其公開(kāi)內(nèi)容并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及攪拌槽容器及相關(guān)方法。
【背景技術(shù)】
[0003]制造生物分子(例如，蛋白質(zhì)，特別是重組蛋白質(zhì))的大致過(guò)程通常包括兩個(gè)主要步驟:(1)在宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的表達(dá)，以及接著(2)蛋白質(zhì)的純化。第一步驟涉及在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所需宿主細(xì)胞以進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。用于該目的的細(xì)胞流水線的一些例子包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、骨髓(NSO)細(xì)菌細(xì)胞(諸如e-coli細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞)。一旦以所需水平表達(dá)蛋白質(zhì)，則蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞移除并收獲。懸浮的顆粒，諸如細(xì)胞、細(xì)胞片段、脂質(zhì)和其它不溶物質(zhì)通常通過(guò)過(guò)濾或離心而從含有蛋白質(zhì)的流體中除去，得到包含所需蛋白質(zhì)溶液以及其它可溶雜質(zhì)的凈化流體。
[0004]第二步驟涉及所收獲的蛋白質(zhì)的純化以移除在過(guò)程中所固有的雜質(zhì)。雜質(zhì)的例子包括宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP，所需或目標(biāo)蛋白質(zhì)之外的蛋白質(zhì))，核酸，內(nèi)毒素，病毒，蛋白質(zhì)變體和蛋白質(zhì)聚集體。該純化通常包括若干層析步驟，可包括在固體基質(zhì)(諸如多孔瓊脂糖、聚合材料或玻璃或通過(guò)基于膜的吸附劑)上的親和層析，離子交換，疏水作用等。
[0005]蛋白質(zhì)純化的層析工藝流程的一個(gè)例子包括蛋白質(zhì)A親和、接著是陽(yáng)離子交換，再接著是陰離子交換。蛋白質(zhì)A柱通過(guò)親和機(jī)制捕獲所需蛋白質(zhì)或目標(biāo)蛋白質(zhì)，而雜質(zhì)通過(guò)該柱以便被丟棄。然后，通過(guò)洗提從該柱回收蛋白質(zhì)。由于大部分所需蛋白質(zhì)具有處于基本范圍(8-9)的等電點(diǎn)(PI)，因此在正常的處理?xiàng)l件下(低于蛋白質(zhì)的PI的pH值)會(huì)帶正電，因此在第二柱中它們結(jié)合到陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。其它帶正電的雜質(zhì)也結(jié)合到該樹(shù)脂。然后，在蛋白質(zhì)洗提而雜質(zhì)保留結(jié)合于樹(shù)脂的情況下(pH值，鹽濃度)通過(guò)洗提從該柱回收所需的蛋白質(zhì)。陰離子交換柱通常操作于流通模式，使得任何帶負(fù)電的雜質(zhì)結(jié)合于樹(shù)脂而帶正電的所需的蛋白質(zhì)回收在流通流中。該過(guò)程導(dǎo)致高度純化和高濃度的蛋白質(zhì)溶液。
[0006]近些年還研究了用于純化蛋白質(zhì)的其它替代性方法。一種方法包括絮凝技術(shù)。在該技術(shù)中，可溶的聚電解質(zhì)添加到未凈化的細(xì)胞培養(yǎng)液中以捕獲懸浮的顆粒和一部分可溶雜質(zhì)，從而形成絮凝物，隨后通過(guò)過(guò)濾或離心將該絮凝物從蛋白質(zhì)溶液移除。
[0007]或者，可溶聚電解質(zhì)添加到凈化的細(xì)胞培養(yǎng)液中，以捕獲所需生物分子，從而形成絮凝物，允許該絮凝物沉降，隨后與溶液的其它部分分離。絮凝物通常被洗滌以松散地除去粘附的雜質(zhì)。然后，溶液離子強(qiáng)度的提高使目標(biāo)蛋白質(zhì)與聚電解質(zhì)分離，隨后導(dǎo)致聚電解質(zhì)的再增溶至含有蛋白質(zhì)的溶液中。
[0008]在2007年12月20日提交的共同待決的美國(guó)申請(qǐng)12/004314(其公開(kāi)通過(guò)引用而結(jié)合于本文)中，在某些條件下(諸如溫度、PH、鹽、光或其組合)可溶的聚合物被用于在其可溶狀態(tài)結(jié)合雜質(zhì)，然后在條件(pH或溫度等)改變后析出，以除去其中的雜質(zhì)。然后，所需的生物分子被利用傳統(tǒng)層析法或膜吸附劑或類似物進(jìn)一步處理。
[0009]以上所述的所有蛋白質(zhì)純化技術(shù)有一個(gè)共同點(diǎn)，S卩，首先在第一獨(dú)立步驟中移除懸浮顆粒，然后在第二步驟中將所需的生物分子與過(guò)程中固有的可溶雜質(zhì)分離。
[0010]利用衍生磁性顆?；厥债a(chǎn)物是蛋白質(zhì)純化技術(shù)的一個(gè)例子，其中，所需的生物分子可以直接從未凈化細(xì)胞培養(yǎng)液純化。在該技術(shù)中，包封磁性珠的聚合物殼以找出并結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的親和配體功能化。然后施加磁場(chǎng)以選擇珠-蛋白質(zhì)復(fù)合物，留下可溶雜質(zhì)和不可溶顆粒。
[0011]該技術(shù)的主要缺點(diǎn)在于其要求在設(shè)計(jì)、結(jié)構(gòu)和高梯度磁性分離器的實(shí)現(xiàn)方面的可觀的資本投資。并且，該技術(shù)還不能應(yīng)用于可置換的應(yīng)用中，這些可置換的應(yīng)用可能成為生物過(guò)程工業(yè)中蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)。
[0012]在2008年12月16日由Moya、Wilson等人提交的共同待決的申請(qǐng)(代理人卷號(hào)MCA-1046，題目為“Purificat1n of Proteins”，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用而結(jié)合于本文)中，公開(kāi)了一種聚合物，諸如可溶聚合物，其能夠基本不可逆地結(jié)合到不可溶顆粒和一部分可溶雜質(zhì)，并還能夠可逆地結(jié)合到未凈化的包含生物材料的流中的一個(gè)或多個(gè)所需生物分子，以及利用這種材料從該流純化一個(gè)或多個(gè)所需生物分子而無(wú)需先期凈化的方法。更具體地，該共同待決的申請(qǐng)公開(kāi)了一種刺激響應(yīng)聚合物，諸如可選擇溶解的聚合物，其能夠可選擇地并可逆地結(jié)合到未凈化的含有生物材料的流中的一個(gè)或多個(gè)所需生物分子，以及使用這種聚合物來(lái)從包括所需生物分子和各種雜質(zhì)(諸如其它蛋白質(zhì)(宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))、DNA、病毒、全細(xì)胞、細(xì)胞碎片等)的材料的復(fù)合混合物中純化一個(gè)或多個(gè)所需生物分子而無(wú)需流的先期凈化的方法。
[0013]聚合物在一定的工藝條件下(諸如pH值，鹽濃度，溫度，光或電場(chǎng)中的一個(gè)或多個(gè))可溶，并且可與不可溶的雜質(zhì)(細(xì)胞，碎片等)以及一部分可溶雜質(zhì)相互作用和復(fù)合，導(dǎo)致在條件(溫度，鹽濃度，光，電場(chǎng)或PH值)的改變下不可溶且析出溶液，例如刺激響應(yīng)聚合物。僅當(dāng)析出溶液后，聚合物能夠在未凈化的細(xì)胞液中的流(蛋白質(zhì)、多肽等)中可逆地結(jié)合到一個(gè)或多個(gè)所需生物分子。然后從流移除析出物，諸如通過(guò)從流的剩余部分濾出，并且通過(guò)諸如從析出物選擇性洗提來(lái)回收所需的生物分子。
[0014]然而，析出物的移除是個(gè)問(wèn)題，因?yàn)槠渫ǔＪ谴髩K污物的形式。
[0015]希望提供一種裝置和方法，來(lái)有效率地純化樣本，特別是包含生物分子的樣本，優(yōu)選在單一的一體的設(shè)備中，其減少或消除可能導(dǎo)致污染或材料損失的一個(gè)或多個(gè)工藝步驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]通過(guò)本文公開(kāi)的實(shí)施例來(lái)克服現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，其包括用于樣本制備或處理(諸如生物體培養(yǎng)或處理以及可選地樣本的純化)的容器或殼體。在某些實(shí)施例中，容器或殼體是混合器。在某些實(shí)施例中，容器或殼體是反應(yīng)器。在某些實(shí)施例中，反應(yīng)器是可置換或可重用的生物反應(yīng)器，其包括攪拌單元裝置，該攪拌單元裝置可模擬切向流過(guò)濾器以減少或消除可能由產(chǎn)生的固體造成的阻塞。在某些實(shí)施例中，固體包括析出物或浮物，諸如包括結(jié)合所需生物分子的聚合物的固體，以及諸如細(xì)胞和細(xì)胞成分的雜質(zhì)。在某些實(shí)施例中，攪拌單元組件包括例如在所需的生物分子的回收(例如，通過(guò)洗提)過(guò)程中用于純化的一個(gè)或多個(gè)膜。在某些實(shí)施例中，生物分子是蛋白質(zhì)、多肽或抗體。在某些實(shí)施例中，容器具有兩個(gè)部分。在某些實(shí)施例中，容器具有兩個(gè)部分，每一部分在其內(nèi)具有膜。在某些實(shí)施例中，容器具有兩個(gè)部分，第一部分具有膜，第二部分與第一部分出口下游的過(guò)濾器裝置流體連通。
[0017]在其方法方面，本文公開(kāi)的實(shí)施例包括對(duì)從細(xì)胞培養(yǎng)流體中獲得的所需生物分子的純化和分離。在某些實(shí)施例中，方法包括在容器或殼體中實(shí)施樣本制備或處理，諸如培養(yǎng)生物體；通過(guò)諸如從培養(yǎng)液析出或絮凝所需生物分子來(lái)產(chǎn)生固體；通過(guò)攪拌防止固體在容器內(nèi)沉降；以及諸如通過(guò)結(jié)合所需生物分子并洗提以及過(guò)濾而進(jìn)行純化。在某些實(shí)施例中，樣本處理包括對(duì)所需蛋白質(zhì)的表達(dá)。在某些實(shí)施例中，固體包括析出物，該析出物包括結(jié)合到所需蛋白質(zhì)的聚合物，并