治療試劑的制作方法
【專利說明】治療試劑
[0001] 本發(fā)明涉及基于與腎上腺髓質(zhì)素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)有關(guān)的細(xì)胞表面多肽的治療試 劑以及鑒定治療試劑的篩選測定方法。
[0002] 置量
[0003] 細(xì)胞信號傳導(dǎo)對于存活是關(guān)鍵的；沒有細(xì)胞信號傳導(dǎo)，物理上或化學(xué)上隔離的細(xì) 胞要經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。在癌細(xì)胞中，很多接觸依賴性的過程是異常的，但是已經(jīng)顯示腎上腺髓 質(zhì)素-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的接受對于腫瘤中80%細(xì)胞的存活是必需的。由于許多激素和細(xì)胞 因子結(jié)合特異性的受體，腎上腺髓質(zhì)素（AM)通過稱為降鈣素受體樣受體（CRLR)的受體來 起作用。
[0004] 生物活性的降鈣素肽家族包括降鈣素、糊精、兩種降鈣素-基因相關(guān)肽（CGRP1和 CGRP2)及腎上腺髓質(zhì)素（AM)。降鈣素是在哺乳動物及大量的非哺乳動物的甲狀腺濾泡旁 "C"細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的32個氨基酸的肽。降鈣素調(diào)節(jié)礦物質(zhì)（鈣和磷酸鹽）的平衡。降鈣素通 過作為誘導(dǎo)骨再吸收的破骨細(xì)胞的抑制劑起作用引起高鈣血癥。CGRP是由降鈣素基因的組 織特異性的加工而產(chǎn)生的37個氨基酸的肽。降鈣素是甲狀腺中的主要產(chǎn)物，而CGRP是神 經(jīng)組織中的主要產(chǎn)物。CGRP是有效的心血管藥物而且具有與糊精結(jié)構(gòu)的相似性。CGRP是 在僅僅相差3個氨基酸的兩種異構(gòu)體（CGRP-I和CGRP-II)中發(fā)現(xiàn)。
[0005] 腎上腺髓質(zhì)素（AM)是52個氨基酸的降血壓肽。其與CGRP具有與糊精的結(jié)構(gòu)相 似性。AM在外周組織、腎上腺髓質(zhì)、肺和腎中產(chǎn)生，并且其在局部缺血中不被調(diào)節(jié)。AM的受 體存在于多種組織中，例如，存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞、眼內(nèi)的虹膜肌、骨、血 管、心臟、腎和皮膚（Uchikawa 等人，Clin Exp Pharmacol Physiol. 2005 年 8 月，第 32 卷 (第 8 期）：第 675-80 頁；Sumanas 等人，Blood. 2005 年 7 月 15 日，第 106 卷（第 2 期）： 第 534-41 頁；Cornish J，Reid J Musculoskelet Neuronal Interact. 2001 年 9 月，第 2 卷（第 1 期）：第 15-24 頁；Yoshihara 等人，Regul. Pept. 2005 年 4 月 15 日，第 127 卷（第 1_3 期）：第 239-44 頁；Matsumoto 等人，Clin Exp Nephrol. 2004 年 11 月，第8 卷（第 4 期）：第 316_21 頁；Muller 等人，Br J Dermatol.2〇〇3 年 1 月，第 148 卷（第 1 期）：第 3〇_8 頁）。通常地，降鈣素肽家族具有6-7個氨基酸的包含二硫腱的N-末端環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及酰胺 化C-末端。
[0006] 降鈣素肽家族通過G-蛋白偶聯(lián)的膜受體（GPCRs)來起作用。降鈣素受體的基因已 經(jīng)被克隆。其與"B"家族中的通常識別調(diào)節(jié)肽（胰泌素、胰高血糖素、VIP)的GPCRs是同源 的。已經(jīng)鑒定出降鈣素受體的同源物：降鈣素受體樣受體（CRLR，也稱為CL)(人：461個氨 基酸；大鼠/小鼠：463個氨基酸），并且該降鈣素受體樣受體與降鈣素受體具有55%的同 源性（Njuki 等人，Clin.Sci?第 85 期，第 385-388 頁（I"3 年）；Chang 等人，Neuron 第 11 期，第 1187-1195 頁（1993 年）；Fluhmann 等人，Biochem.Biophys.Res.Comun?第 206 期， 第 341-：347 頁（I"5 年）；Kapas 等人，J. Biol. Chem?第 27〇 期，第 25344_25347 頁（1"5 年））。經(jīng)鑒定，GPCR "A"家族的兩個相關(guān)成員：RDC1和G10D分別為CGRP和AM的受體。
[0007] CRLR不能夠單獨地傳導(dǎo)應(yīng)答AM的信號，因為RAMP (受體活性修飾蛋白）的存在 對于引發(fā)配體的特異性、CRLR的結(jié)合與激活是必要的。RAMPs是小內(nèi)源性膜蛋白族，具有 14, 000-17, OOOOKd的預(yù)定大小。RAMPs由約120個氨基酸組成，具有約100個氨基酸的大 型胞外域、單獨的跨膜區(qū)和約10個氨基酸的短的胞內(nèi)區(qū)。
[0008] 已經(jīng)顯示，CRLR可以作為CGRP受體或AM受體來實現(xiàn)，取決于RAMP家族的成員即 RAMPs 1-3中的哪些被表達(dá)。RAMP1、2和3含有N-末端信號肽、胞外的N-末端、靠近C-末 端的單獨的跨膜區(qū)和胞漿C-末端。RAMP1-3顯示了 31 %的同一性。RAMP-2和RAMP-3具有 大約30%的同一性。RAMPS可能涉及CRLR到質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運。
[0009] RAMP家族的三個成員，即RAMP1、2和3,造成了如下的CRLR的不同配體的特異性：
[0010] RAMP1+CRLR = CGRP 受體
[0011] RAMP2+CRLR = AM 受體
[0012] RAMP3+CRLR = AM 受體
[0013] RAMP1使質(zhì)膜上的CRLR呈現(xiàn)為末端糖基化的、成熟的糖蛋白和CGRP受體，而 RAMP2和RAMP3使CRLR呈現(xiàn)為不成熟的、核心糖基化的ADM受體（McLatchie等人，1998 年）。
[0014] 本發(fā)明涉及通過對RAMP-CLRL相互作用的影響能力來鑒定治療試劑。這樣的試劑 為尤其是癌癥治療的靶點。
[0015] 發(fā)明簡沐
[0016] 在本發(fā)明的第一方面，提供了能夠結(jié)合到或是調(diào)節(jié)一種或多種RAMP蛋白（受體活 性修飾蛋白）的降鈣素受體樣受體（CRLR)的作用的試劑，所述的一種或多種RAMP蛋白選 自：（i)RAMP-3、（ii)RAMP-2 和（iii)RAMP-l 蛋白。
[0017] 在一種實施方案中，所述試劑結(jié)合至RAMP蛋白的胞外域。在一種特定的實施方案 中，所述RAMP蛋白是人的RAMP蛋白。尤其是，所述試劑可以是能夠調(diào)節(jié)RAMP-3和CRLP的 相互作用。
[0018] 在一種實施方案中，本發(fā)明的制劑與至少一種選自如下的配體結(jié)合：
[0019] (a) 1-31個氨基酸殘基的肽段，所述肽段包括在如圖3中所示的人RAMP-3蛋白的 第1位到第31位的連續(xù)氨基酸序列中所包含的連續(xù)氨基酸殘基的序列；
[0020] (b) 1-15個氨基酸殘基的肽段，所述肽段包括如圖3中所示的人RAMP-3蛋白的第 32位到第46位的連續(xù)氨基酸序列中所包含的連續(xù)氨基酸殘基的序列；和
[0021] (c) 1-53個氨基酸殘基的肽段，所述肽段包括如圖3中所示的人RAMP-3蛋白的第 47位到第99位的連續(xù)氨基酸序列中所包含的連續(xù)氨基酸殘基的序列。
[0022] 在一種實施方案中，所述試劑與至少一種選自如下的配體結(jié)合：
[0023] (a) 1-32個氨基酸殘基的肽段，所述肽段包括如圖3中所示的人RAMP-3蛋白的第 1位到第32位的連續(xù)氨基酸序列中所包含的連續(xù)氨基酸殘基的序列；
[0024] (b) 1-14個氨基酸殘基的肽段，所述肽段包括如圖3中所示的人RAMP-3蛋白的第 33位到第46位的連續(xù)氨基酸序列中所包含的連續(xù)氨基酸殘基的序列；
[0025] (c) 1-53個氨基酸殘基的肽段，所述肽段包括如圖3中所示的人RAMP-3蛋白的第 47位到第99位的連續(xù)氨基酸序列中所含的連續(xù)氨基酸殘基的序列。
[0026]所述肽段通常為5-15個氨基酸的長度。肽段（a)、（b)和（c)各自獨立地具有5、 6、7、8、9、10、11、12、13或14個氨基酸殘基。它們可以具有5-13個、5-11個或5-9個殘基 例如13個氨基酸殘基、11個氨基酸殘基或9個殘基。也在本發(fā)明范圍之內(nèi)的是（各自獨立 地）具有5、6、7、8、10、12、14或15個氨基酸殘基的肽段（a)、（b)和（c)。更多氨基酸殘基 數(shù)目的肽段仏)、〇3)和（〇)可能是包含17、18、19、20、25或30個殘基。肽段（(3)可以具有 的更多氨基酸殘基數(shù)目包括，例如31、32、35、40、45、50和53個氨基酸殘基。本發(fā)明的試劑 可以結(jié)合至包含至少一個本文所述的肽段的抗原表位上。
[0027] 肽段（b)可包括全部或部分推定的CRLR結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述試劑可以結(jié)合至人的 RAMP-3片段，該片段是通過使用人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和人鈣蛋白酶-1來酶消化 RAMP-3細(xì)胞外區(qū)域而制備的。
[0028] 本發(fā)明公開內(nèi)容中還包括結(jié)合到至少一種選自如下的肽段上的試劑：
[0029] (a) 1-15個氨基酸殘基的肽段，所述肽段包括在以下氨基酸序列中包含的連續(xù)氨 基酸殘基的序列：
[0030] GCPRAGGCNE TGMLERLPLC GKAFADMMGK VDVWKWCNL；
[0031] (b) 1-15個氨基酸殘基的肽段，所述肽段包括在以下氨基酸序列中包含的連續(xù)氨 基酸殘基的序列：
[0032] ESFT NCTEMEANW GCYWPNPLAQ GFITGIHRQF FSNCTVDRVHLEDPPDEVL〇
[0033] 上面示出的序列包含在RAMP-3蛋白中，所述RAMP-3蛋白包括例如圖3的氨基酸 序列。
[0034] 本發(fā)明的試劑任選地具有下面的兩種能力的一種或多種：
[0035] 1、能夠抑制表達(dá)所述RAMP和CRLR蛋白的SW-13細(xì)胞至少10%的增殖，其中所述 增殖是使用MTT細(xì)胞增殖試驗來測量的；
[0036] 2、與缺乏所述試劑而給藥腎上腺髓質(zhì)素相比較，就腎上腺髓質(zhì)素的給藥，能夠抑 制人MG63骨肉瘤細(xì)胞中cAMP至少約15%的生成。
[0037] 所述試劑可以是能夠結(jié)合至RAMP蛋白例如RAMP-3上。在一種實施方案中，所述 試劑與RAMP-3的胞外域相結(jié)合，例如含有圖3的氨基酸殘基1-99的序列。
[0038] 在此公開的數(shù)據(jù)可以表明，無論是在RAMP-3和CRLR之間相互作用的抑制劑或者 是在RAMP-3/CRLR結(jié)合復(fù)合物及配體如腎上腺髓質(zhì)素之間相互作用的抑制劑均可以用于 預(yù)防癌癥或血管生成。這樣的制劑還可以用于治療糖尿病，包括緩解糖尿病癥狀例如糖尿 病微血管病。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了調(diào)節(jié)多肽對于降鈣素受體樣受體（CRLR)功能的 作用的試劑，其中所述多肽選自：
[0040] i)多肽或其變體，由圖1、2或3所示的核酸序列組成的核酸分子編碼；
[0041] ii)由核酸分子編碼的多肽，所述核酸分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至如以上（i)所定 義的核酸分子并調(diào)節(jié)CRLR功能；和
[0042] iii)含有核酸的多肽，所述核酸由于遺傳密碼而與⑴和（ii)中定義的核酸序列 是簡并的，其特征在于，所述試劑是作為藥物使用。
[0043] 本文所使用的"CRLR的功能或活性"是指CRLR的任意生物學(xué)活性。具體"功能" 包括在應(yīng)答配體中的CRLR激活，所述配體的例子包括腎上腺髓質(zhì)素（AM)和CGRP。應(yīng)答AM 或CGRP的CRLR激活通常引起cAMP的表達(dá)以及其它第二信使系統(tǒng)的激活。
[0044] 由于配體如AM或CGRP會結(jié)合至本發(fā)明的多肽，即RAMP蛋白，因此，只有當(dāng)所述多 肽與CRLR相結(jié)合時，本發(fā)明的試劑可用于調(diào)節(jié)例如干擾RAMP蛋白與CRLR的結(jié)合。通過干 擾RAMP蛋白例如RAMP-1、RAMP-2和RAMP-3與CRLR的結(jié)合，可以影響例如降低或甚至是 阻止CRLR的激活。所述的干擾可以是例如直接或間接地阻斷位于RAMP蛋白上、CRLR上和 /或RAMP/CRLR復(fù)合物內(nèi)的配體的結(jié)合位點的結(jié)果。在一種實施方案中，所述試劑結(jié)合至 RAMP-3蛋白的胞外域的氨基酸序列，該氨基酸序列不是CRLR結(jié)合區(qū)域。在一種選擇性的 實施方案中，所述試劑可以是激動劑，這就是說，模擬所述RAMP/CRLR受體與配體的相互作 用，并且因此可以導(dǎo)致CRLR受體的興奮以及由受體產(chǎn)生的增加的或異常的信號傳導(dǎo)。
[0045] 在一種優(yōu)選的實施方案中，所述試劑是抗體產(chǎn)品。在一種實施方案中，所述抗體產(chǎn) 品結(jié)合至RAMP-3蛋白。所述抗體可以特異性地結(jié)合至RAMP-3。
[0046] 本發(fā)明公開的范圍內(nèi)包括用作藥物的所述試劑。
[0047] 在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，當(dāng)所述試劑為例如抗體產(chǎn)品或蛋白如融合蛋白時，提 供適合于表達(dá)本發(fā)明試劑的載體。本發(fā)明還提供了已經(jīng)以在此所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞。
[0048] 在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了制備本文所述的試劑例如抗體的方法。
[0049] 若干實施例的詳細(xì)說明
[0050] 在本說明書中使用以下術(shù)語和縮略語：
[0051] 定義
[0052] 除非另外指出，技術(shù)術(shù)語是根據(jù)其常規(guī)的用法來使用。分子生物學(xué)中常見術(shù)語的 定義可以在 Benjamin Lewin，Genes V，Oxford University Press 出版，1994 年（ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew 等人（編輯），The Encyclopedia of Molecular Biology， Blackwell Science Ltd 出版，1994 年（ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A.Meyers(編 輯），Molecular Biology and Biotechnology ：a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers，Inc.出版，1995年（ISBN 1-56081-569-8)中找出。免疫學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員 已知的定義和附加信息可以在例如Fundamental Immunology，W. E. Paul編輯，第四版， Lippincott-Raven Publishers，1999 年中找出。
[0053] 抗體片段（與特異性抗原結(jié)合的片段）：已經(jīng)定義了抗體的不同片段，包括Fab、 (Fab' )2、Fv、dsFV、單鏈Fv(scFv)和域抗體包括單域抗體。將這些抗體片段定義如下： (l)Fab，包含抗體分子的單價抗原結(jié)合片段的片段，由所述片段是用木瓜蛋白酶消化整個 抗體或是通過基因工程的等效方法來得到完整的輕鏈和重鏈的一部分；(2)Fab'，抗體分 子片段，通過以胃蛋白酶處理整個抗體，然后還原以產(chǎn)生完整的輕鏈以及重鏈的一部分；每 個抗體分子均獲得兩個Fab'片段；（3) (Fab' )2，抗體片段，通過以胃蛋白酶處理整個抗體 但不經(jīng)過隨后的還原或基因工程等效方法來獲得；(4) F (Ab') 2，通過二硫鍵將兩個FAb' 片段連在一起形成的二聚體；(5) Fv，基因工程產(chǎn)生的片段，包含表達(dá)為兩條鏈的輕鏈可變 區(qū)和重鏈可變區(qū)；dsFV，其為通過二硫鍵連接的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，和（6)單鏈抗體 ("SCA")，基因工程產(chǎn)生的分子，包含通過適宜的多肽接頭如基因融合的單鏈分子來連接的 輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)。單鏈抗體還可以稱為單鏈可變片段（scFv)。
[0054] 單域抗體是其互補(bǔ)決定區(qū)為單域多肽一部分的抗體。其例子包括但不限于重鏈抗 體、輕鏈天然缺失抗體、衍生自常規(guī)的4鏈抗體的單域抗體、工程抗體和非衍生自抗體的單 域支架。單域抗體可以是任何現(xiàn)有技術(shù)中的或任何未來的單域抗體。單域抗體可以衍生自 任何種類的包括但不限于鼠、人、駱駝、駱馬、山羊、兔子、牛。單域抗體可以是稱為無輕鏈的 重鏈抗體的天然存在的單域抗體。例如，這樣的單域抗體公開于WO 9404678中。制備這些 片段的方法均是現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的。
[0055] dAB (域抗體）是抗體的最小功能性結(jié)合單元，其對應(yīng)于人抗體的重鏈（VH)或輕鏈 (VL)的可變區(qū)。域抗體具有約13kDa的分子量，或者少于整個抗體1/10的大小。域抗體可 包括結(jié)合至兩個治療祀點的dAbs。這些祀點包括：IgG_樣分子、聚乙二醇化的（PEGylated) 融合蛋白和抗血清白蛋白的融合蛋白。在所述IgG-樣抗體中，兩個可變區(qū)結(jié)合至IgG每條 臂上的兩個治療靶點。
[0056] 細(xì)胞系/細(xì)胞培養(yǎng)物"細(xì)胞系"或"細(xì)胞培養(yǎng)物"表示更高的真核細(xì)胞的體外生長 或保持。理解的是，細(xì)胞的子代可以與親代細(xì)胞不完全相同（形態(tài)學(xué)上、基因型上或表型 上）。"異源的"是指衍生自基因型上不同于與其比較的其余主體的主體。例如，多核苷酸 可以通過基因工程技術(shù)置入衍生自不同來源的質(zhì)?；蜉d體，并且其是異源的多核苷酸。從 其天然編碼序列中除去的啟動子以及有效地連接到未發(fā)現(xiàn)有天然連接的編碼序列上的啟 動子是異源啟動子。"分離的"多核苷酸或多肽是基本上不含與其天然結(jié)合的物質(zhì)?；旧?不含是指不含有至少50 %，優(yōu)選為至少70 %，更優(yōu)選為至少80 %，而且甚至更優(yōu)選為至少 90 %的與其天然結(jié)合的物質(zhì)。
[0057] 互補(bǔ)性決定區(qū)（⑶R):⑶Rs是在抗體分子各個輕鏈可變區(qū)（VL)和重鏈可變區(qū) (VH)之內(nèi)的三個高度可變區(qū)，所述抗體分子形成與所結(jié)合抗原的三維結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的抗原結(jié) 合表面。從重鏈或輕鏈的N-末端開始，這些互補(bǔ)性決定區(qū)是分別表示為"⑶R1"、"⑶R2" 和"CDR3"。CDRs涉及抗原-抗體的結(jié)合，并并且所述CDR3包含有專門用于抗原-抗體結(jié) 合的獨特區(qū)域。因此，抗原結(jié)合位點可以包括六個CDRs，該CDR區(qū)域包括各個重鏈和輕鏈 可變區(qū)（V region)。CDR區(qū)域內(nèi)單個氨基酸的變更可以改變抗體對特異性抗原的親合力 (參見Abbas 等人，Cellular and Molecular Immunology，第4 版，143-5,2000 年）。例 如由 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunologic Interest，（免疫的蛋白質(zhì)序 列）U.S. Department ofHealth and Human Services，1983 年已經(jīng)精確定義了 CDRs 的位 置。Ig的輕鏈和重鏈各自具有三個CDRs，分別定義為L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3以及H-CDR1、 H-CDR2、H-CDR3。通過定義，輕鏈的 CDRs 通過 24 和 34 位（L-CDR1)、50 和 56 位（L-CDR2)、 89和97位（L-CDR3)的殘基來結(jié)合；重鏈的CDRs通過31和35b位（H-CDR1)、50和65 位（H_CDR2)、95 和 102 位（H-CDR3)的殘基來結(jié)合，使用由 Kabat 等人，（1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Department of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda(NIH 公開 號91-3242)所描述的編號規(guī)定。
[0058] 參考 Kabat，E. A 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，MD (1987)和（1991)的編號方案。 在這些綱要中，Kabat列出了各個亞類的抗體的許多氨基酸序列，并且列出了所述亞類中 各個殘基位置的最常存在的氨基酸。Kabat使用了將殘基數(shù)分配到所列出序列中的各個 氨基酸的方法，并且這種用于分配殘基數(shù)的方法已經(jīng)成為本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)。就本發(fā)明的目的 而言，將殘基數(shù)分配給未包括在Kabat的綱要中的侯選抗體的氨基酸序列，然后進(jìn)行以下 步驟。通常地，所述侯選序列是用Kabat中的任何免疫球蛋白序列或任何共有序列來排列 (aligned)。排列可以通過手工進(jìn)行，或者通過使用常規(guī)認(rèn)可的電腦程序由電腦進(jìn)行；這種 程序的例子是本說明書中所討論的排列程序2。排列可以通過使用對大多數(shù)Fab序列是常 見的一些氨基酸殘基來促進(jìn)。例如，輕鏈和重鏈通常各自具有兩個具有相同殘基數(shù)的半胱 氨酸；在VL域中，所述兩個半胱氨酸通常在殘基數(shù)23和88上；而在VH域中，所述兩個半胱 氨酸通常在殘基數(shù)22和92上?？蚣軞埢ǔ５氐⒉皇强偸蔷哂写蠹s相同數(shù)量的殘基， 然而，所述CDRs會在大小上改變。例如，在來自侯選序列的CDR比Kabat中排列的序列中 CDR長的情況下，通常在殘基數(shù)上加后綴以表明插入另外的殘基（參見，例如圖5中的殘基 lOOabcde)。對于侯選序列而言，例如，所述候選序列以Kabat序列來排列殘基34和36但 是在它們之間沒有以殘基35來排列的殘基，則簡單地將數(shù)目35不分配給殘基。
[0059] Q)R和FR的殘基還根據(jù)結(jié)構(gòu)定義來確定（如在Chothia和Lesk，J. Mol. Biol. 196 : 901-917(1987)中）。當(dāng)這兩種方法導(dǎo)致⑶R的鑒定略有不同時，優(yōu)選結(jié)構(gòu)定義，但是由序 列定義方法所鑒定的殘基被認(rèn)為是對于確定以哪種框架殘基輸入共有序列而言重要的FR 殘基。
[0060] 恒定區(qū)：抗體分子賦予效應(yīng)物功能的部分。在本發(fā)明的公開內(nèi)容中，使用的變異抗 體可以包括來源于人免疫球蛋白類的恒定區(qū)。所述重鏈恒定區(qū)可以選自五個種型中的任何 種型：a、S、e、丫或y。不同亞類的重鏈（如IgG亞類的重鏈）是造成不同效應(yīng)物功能 的原因。因此，通過選擇所期望的重鏈恒定區(qū)，可以制得具有所期望的效應(yīng)物功能的人源化 抗體。輕鏈恒定區(qū)可以是k或A型。
[0061] 表位：抗原上的位點是通過試劑來識別如通過氨基酸序列的特異性來確定。如果 例如在競爭性結(jié)合試驗中測量到兩種試劑中的每種試劑競爭地抑制（阻斷）另一種試劑 結(jié)合至所述抗原，則該兩種試劑被認(rèn)為是結(jié)合至相同的表位（參見，例如Junghans等人， Cancer Res. 50 :1495-1502,1990)。選擇性地，如果降低或消除一種抗體結(jié)合的所述抗原中 的大多數(shù)氨基酸的突變，也降低或消除另一種