一種金龜子綠僵菌mayx130921及其應用
【技術領域】：
[0001 ] 本發(fā)明屬于微生物技術領域，尤其涉及一種金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae)MAYX130921 及其應用。
【背景技術】：
[0002] 暗黑鮑金龜HolotrichiaparallelaMotschulsky是重要的農業(yè)地下害蟲，其成 蟲（金龜子）取食危害作物地下部葉片，幼蟲長期生活于土中取食危害植物地下根莖和塊 根（莖），引起土壤中細菌等微生物的侵染造成地下根莖腐爛。對暗黑鰓金龜幼蟲的防治 方法，一度以化學防治為主，化學防治雖在一定程度降低了蠐螬的危害程度，但卻不能根治 蠐螬為害，而且由于化學農藥的不當使用，加劇了土壤和水系污染，農產品的農藥殘留也超 標。這些負面影響使人們在防治中更加關注起生物防治，弧麗鉤土蜂是暗黑鰓金龜幼蟲的 寄生性天敵昆蟲，釋放弧麗鉤土蜂防治暗黑鰓金龜也取得了一定成效，然而由于弧麗鉤土 蜂作為一種天敵昆蟲，種群繁殖周期較長，再加上其活動性較強，受環(huán)境的影響較大，因此 影響了大面積的推廣應用。綠僵菌作為一類重要的昆蟲病原真菌，對人、畜、植物安全，害蟲 極少或不產生抗性，有利于環(huán)境保護。因此，研究暗黑鰓金龜幼蟲的生物防治，避免或減少 因不合理使用化學農藥所帶來的抗藥性問題，已成為暗黑鰓金龜科學治理和可持續(xù)控制的 重要選擇。
[0003] 金龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae)MAYX130921屬于半知菌亞門絲孢綱綠 僵菌屬。據記載，金龜子綠僵菌小孢變種寄主廣泛，在生物防治中具有重要價值，而對暗黑 鰓金龜幼蟲的侵染還未見報道。

【發(fā)明內容】
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[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種金龜子綠僵菌MAYX130921及其應用，旨在克服現有 的金龜子綠僵菌未發(fā)現能寄生暗黑鰓金龜的不足，通過生物技術手段防治暗黑鰓金龜，避 免或減少因不合理使用化學農藥所帶來的抗藥性問題。
[0005] 本發(fā)明是這樣實現的，一種金龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae) MAYX130921，于2014年12月4日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 號為CGMCCNo. 10139,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0006] 本發(fā)明的進一步的目的在于提供上述金龜子綠僵菌MAYX130921在暗黑鰓金龜防 治方面的應用。本發(fā)明于2013年9月，在云南省玉溪市峨山縣田間調查時發(fā)現金龜子綠僵 菌在暗黑鰓金龜幼蟲中大量發(fā)生流行，引起大量暗黑鰓金龜幼蟲感染死亡。因此，該菌株是 目前國內首次發(fā)現的寄生暗黑鰓金龜、流行性很強的蟲生真菌，在防治暗黑鰓金龜中具有 很大的開發(fā)應用前景。
[0007] 本發(fā)明從罹病暗黑鰓金龜幼蟲上分離獲得金龜子綠僵菌野生菌株，將野生菌株回 接于暗黑鰓金龜成蟲上復壯得到金龜子綠僵菌菌株，對該菌株采用按常規(guī)方法進行單孢分 離、培養(yǎng)得到純的、致病力強的金龜子綠僵菌。在SDAY培養(yǎng)基上，菌落絨毛狀至棉絮狀， 最初時為白色，產孢時呈橄欖綠色。在光學顯微鏡（400倍）可以看到菌絲具分隔分枝， 透明，直徑為1. 5~2. 0ym。分生孢子梗直徑約2ym，其末端產生瓶形小梗，8~16 ( - 25)X1. 5~2(2. 2)ym。從瓶梗末端以向基式連續(xù)形成長串鏈的分生孢子。分生孢子單細 胞，長橢圓形至圓柱狀，兩端鈍截形至鈍圓，大小變化甚大，5~7( - 9)X2~3(4. 5)ym。 孢子單個存在時色亮，成堆時橄欖綠色，脫落的孢子常聚成菱形孢子團塊或殼狀結構。在 SDAY培養(yǎng)基上生長較快，接種后前8天內菌落直徑日增長0. 64cm。
[0008]相比于現有技術的缺點和不足，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明是初次從暗黑 鰓金龜體上分離得到的菌株，培養(yǎng)比較簡單，生長快速，產孢量大，孢子萌發(fā)率高。其分生孢 子對暗黑鰓金龜幼蟲致病力強，環(huán)保無污染、不易產生抗藥性，可以廣泛地用于暗黑鰓金龜 的防治。
【具體實施方式】：
[0009] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限 定本發(fā)明。
[0010] 實施例一、病原菌的分離、鑒定
[0011] 1.1材料與方法
[0012] 1.1.1 材料
[0013]在云南省玉溪市峨山縣采集到被一種蟲生真菌侵染后的罹病暗黑
[0014]鰓金龜幼蟲。
[0015] 薩氏培養(yǎng)基（SDAY) :1 %蛋白胨+1 %酵母粉+4 %葡萄糖+1.5~2%瓊脂粉 +1000ml水。
[0016] 無菌操作條件：所有的器皿和用具均經高溫滅菌鍋（12rc，30min)，接種等操作 均在超凈工作臺內進行。
[0017]培養(yǎng)條件：置于28°C光照（12L:12D)恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉移到試管SDAY斜面，培養(yǎng)3~5天，轉入4°C冰箱儲存。
[0018] LL2病原菌的分離和純化
[0019] 分離：從罹病暗黑鰓金龜幼蟲尸體上分離病原菌。將暗黑鰓金龜幼蟲罹病蟲體帶 回實驗室，將暗黑鰓金龜幼蟲尸體按順序依次經過70%酒精浸泡30秒、再經過0. 1%升汞 溶液浸泡3分鐘（徹底消毒）、最后用無菌水沖洗三次，再用接種針取處理好的暗黑鰓金龜 幼蟲組織接種于SDAY培養(yǎng)基上。在溫度為28°C條件下培養(yǎng)，長出菌絲后按常規(guī)方法進行 單孢分離、培養(yǎng)得到純的、產孢能力強的菌株金龜子綠僵菌，轉移到SDAY斜面上生長3~4 天，在4°C冰箱儲存。
[0020] 復壯：將分離到的菌株在SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)5~7天后，產生大量分生孢子，再將 該分生孢子挑入含1 %吐溫-80的無菌水，用玻璃棒攪拌均勻，得到適當濃度（10s孢子/mL) 的孢子懸浮液，用小型噴霧器均勻噴于暗黑鰓金龜幼蟲體表（以蟲體表面濕潤為度），保持 相對濕度80%以上。收集死蟲并保濕，得到的罹病幼蟲再按以上方法分離得到致病力更強 的菌株。
[0021] 純化：挑取培養(yǎng)基上分生孢子粉，再次接種在新的培養(yǎng)基上。如此培養(yǎng)2~3代， 菌株就被純化。
[0022] 1.1. 3病原菌的鑒定
[0023] 根據病原菌的培養(yǎng)性狀、菌絲和分生孢子的形態(tài)進行鑒定。利用40X10倍光學顯 微鏡，鏡檢菌絲、分生孢子和分生孢子梗的形態(tài)。
[0024] 1. 2 結果
[0025] 從被蟲生真菌自然侵染的暗黑鰓金龜幼蟲蟲體上分離獲得野生菌株，在薩氏瓊脂 葡萄糖培養(yǎng)基（SDAY)上培養(yǎng)，并回接于暗黑鰓金龜幼蟲復壯獲得一菌株，對該菌株進行單 菌絲分離獲得純化的菌株，即龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae)MAYX130921。
[0026] 在光學顯微鏡（400倍）可以看到在該菌株菌絲具分隔、分枝，透明，直徑為1. 5~ 2.0ym。分生孢子梗直徑約2 ym，其末端產生瓶形小梗，8~1