一種好氧反硝化菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程、環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種好氧反硝化菌株及其應(yīng)用,同 時(shí)提供這種菌株的脫氮效能。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前,隨著國民經(jīng)濟(jì)地迅速發(fā)展和城市化進(jìn)程地不斷深入,城市生活和工業(yè)廢水 的排放總量也在逐年增加。而農(nóng)藥、化肥和合成洗滌劑等的廣泛使用,使得水體中的營養(yǎng)物 質(zhì)濃度不斷升高,其中氮是引起水體富營養(yǎng)化的主要原因之一。常規(guī)的生化處理工藝可以 有效地降低污水中的B0D和SS,但當(dāng)污水中同時(shí)存在的N,P等營養(yǎng)物的時(shí)候,只能去除污 水中氮的30-40 %,大量含氮污水將直接排入環(huán)境水體。
[0003] 傳統(tǒng)的生物脫氮包括好氧硝化和缺氧反硝化兩個(gè)過程,即首先在好氧條件下,亞 硝酸鹽將氨氮氧化為亞硝酸鹽,而后硝酸菌將亞硝酸氮進(jìn)一步氧化為硝酸氮。隨后在缺氧 條件下,反硝化菌將硝酸氮或亞硝酸氮還原成氣體氮或者隊(duì)0。好氧反硝化具有以下優(yōu)點(diǎn): (1)在有氧條件下進(jìn)行反硝化,使得同步硝化反硝化(SND)成為可能;(2)硝化反應(yīng)的產(chǎn) 物可直接成為反硝化反應(yīng)的底物,避免了培養(yǎng)過程亞硝酸鹽和硝酸鹽的積累對(duì)硝化反應(yīng)的 抑制,加速了硝化和反硝化進(jìn)程.同時(shí),反硝化會(huì)補(bǔ)償硝化反應(yīng)消耗的堿度,維持了反應(yīng)系 統(tǒng)pH值穩(wěn)定,降低了操作難度和運(yùn)行成本;(3)大部分好氧反硝化菌適應(yīng)性較強(qiáng)、生長速 度快、產(chǎn)量高并且對(duì)溶解氧濃度要求較低,反硝化速度快且徹底,適合治理大面積氮污染水 域。好氧反硝化技術(shù)作為一種全新的脫氮技術(shù)備受研究者關(guān)注。
[0004] 到目前為止,好氧反硝化菌株主要集中在Pseudomonas菌屬、Bacillus菌屬和 Aeromonas菌屬,菌種較為單一,且研究多集中在降解基因和降解機(jī)理方面,實(shí)際應(yīng)用研究 有限。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種好氧反硝化菌(Aeromonassp. )AD_3。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供該菌株AD-3在水處理中的應(yīng)用效能。
[0007] 為達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008] -種好氧反硝化菌,該菌株為(Aeromonassp. )AD_3,保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào),保藏日期為 2015年7月14日,保藏編號(hào)為CGMCCNo. 11069。
[0009] 本發(fā)明所提供的好氧反硝化菌株的用途是用于處理含氮廢水。
[0010] 本發(fā)明所提供的好氧反硝化細(xì)菌(Aeromonassp. )AD-3,經(jīng)鑒定為革蘭氏陰性桿 菌,專性需氧菌,生長溫度范圍25-42°C,最適生長溫度為25-30°C,特別是該菌在4°C不生 長而在42°C可以生長,菌體長度為1. 5-5. 0ym,寬度為0? 5-1ym,呈球桿狀或線狀,成對(duì)或 短鏈狀排列,菌體一端有單鞭毛,無芽孢。
[0011] 本發(fā)明的(Aeromonassp. )AD_3 的生理生化:菌株(Aeromonassp.AD-3)的生理 生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版操作,鑒定結(jié)果為Aeromonas sp. AD-3為非發(fā)酵 革蘭氏陰性菌,專性需氧菌,生長溫度范圍25-42°C,最適生長溫度為25-30°C,特別是該菌 在4°C不生長而在42°C可以生長。菌體長度為1. 5-5. 0ym,寬度為0? 5-1ym,呈球桿狀或 線狀,成對(duì)或短鏈狀排列,菌體一端有單鞭毛,無芽孢。該菌株不需要有機(jī)生長因素。營養(yǎng) 多樣化:單個(gè)菌株的生長可利用76-82種或更多的不同有機(jī)化合物。對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染 色,氧化酶,接觸酶,葡萄糖氧化發(fā)酵,產(chǎn)吲哚,V.P.測定,M.R.測定,明膠液化,淀粉水解, 檸檬酸鹽利用,硝酸鹽還原等主要生理生化指標(biāo)試驗(yàn),結(jié)果如表1所示。
[0012] 表 1(Aeromonassp. )AD_3 的生理生化指標(biāo)
[0013]
[0014] 本發(fā)明包含以下有益效果:
[0015] 本發(fā)明所提供的(Aeromonassp. )AD_3的基因具有較高的好氧反硝化性能。可用 于污水生物脫氮工藝總氮去除率高達(dá)87. 7%,這些特點(diǎn)在水處理領(lǐng)域具有重大意義。
【附圖說明】
[0016] 圖1是菌株(Aeromonassp. )AD_3的生長曲線圖;
[0017] 圖2是菌株AD-3對(duì)總氮的去除效能圖。
【具體實(shí)施方式】
【具體實(shí)施方式】 [0018] 一:本實(shí)施方式的一種好氧反硝化菌,該菌株為(Aeromonassp.) AD-3,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏地址是北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào),保藏日期為2015年7月14日,保藏編號(hào)為CGMCCNo. 11069。
[0019] 本實(shí)施方式的(Aeromonassp. )AD_3是通過以下方式獲得的:
[0020] a.取SBR反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定運(yùn)行半個(gè)月的缺氧段末的活性污泥作為分離用泥;
[0021] b.采用稀釋混合平板法進(jìn)行分離:對(duì)己分離出來的菌株在好氧條件下置于反硝 化培養(yǎng)基中進(jìn)行脫氮試驗(yàn),同時(shí)輔助進(jìn)行硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)及異染顆粒染色(亞甲基藍(lán) 染色法)檢驗(yàn)。對(duì)于硝酸還原性為陽性并產(chǎn)氣,且在好氧條件下能降低TN濃度的細(xì)菌即為 好氧反硝化菌種屬。
[0022] 具體分離步驟為:從SBR反應(yīng)器缺氧段末取10mL活性污泥至裝有90mL無菌水的 三角瓶中,加入無菌玻璃珠;將三角瓶放入搖床中充分振蕩,使細(xì)菌呈單細(xì)胞狀態(tài)分散于水 中。然后,從三角瓶內(nèi)的污泥菌懸液中取lmL懸液接入裝有9mL無菌水的試管內(nèi),得到10 1 梯度的菌懸液,繼續(xù)此步驟,依次得到10 2、10 3、10 4……10 7梯度的菌懸液,各取lmL水樣 放入培養(yǎng)皿種,待培養(yǎng)基快凝卻時(shí)倒入培養(yǎng)皿中,混勻,待培養(yǎng)基凝固后倒置培養(yǎng)皿于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3天后,分別選取不同形態(tài)、菌落清晰的典型菌落,標(biāo)記并挑取單個(gè) 菌落在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線分離,重復(fù)3~4次至菌落特征一致的單菌落,最后挑取 單一菌落,轉(zhuǎn)接到準(zhǔn)備好的試管斜面上以備用;上述所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。
[0023] 所述的反硝化培養(yǎng)基成分(g/L)為:丁二酸鈉4. 7 ;磷酸氫二鈉7. 9 ;磷酸二氫鉀 1. 5 ;氯化銨0. 3 ;硫酸鎂0. 1 ;硝酸鉀1. 5 ;微量元素lml。微量元素成分(g/L):EDTA50 ;硫 酸亞鐵5. 0 ;硫酸鋅2. 2 ;鉬酸銨1. 1 ;氯化鈣5. 5 ;硫酸銅1. 57 ;氯化錳5. 06 ;氯化鈷1. 61. pH= 7. 2~7. 5 ;溫度30°C左右。
[0024] c.對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行分子鑒定,按以下步驟進(jìn)行:
[0025] 提取菌株的DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,然后利用膠回收試劑盒(回收純化PCR產(chǎn)物,之 后進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化,篩選陽性克隆子菌落,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行測序,測序結(jié)果位測得長度為 1460bp的序列,如序列表SeqIDNo:1所示,其序列提交至GenBank,以確定菌株的種屬關(guān) 系,最終確定為氣單孢菌屬(Aeromonassp.)。通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化 鑒定結(jié)果其為好氧反硝化菌(Aeromonassp. )AD-3。
[0026] 所述的PCR擴(kuò)增過程的具體步驟為:
[0027] 1)PCR體系建立(25yL):
[0028]
[0029]
[0030] 2)PCR程序設(shè)定:
[0031] 預(yù)變性 95°C3min,
[0032] 95°C預(yù)變性 5min,94°C變性lmin,58°C復(fù)性 30s,72°C延伸 3min,共 30 個(gè)循環(huán),最 后 72°C延伸 10min;
[0033] 3)引物序列:
[0034] 引物 1 5 ' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 '
[0035] 引物 2 5 ' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 '。
[0036] 所述的生理生化鑒定如下:菌株(Aeromonassp.AD-3)的生理生化鑒定參照《伯 杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版操作,鑒定結(jié)果為Aeromonassp.AD-3為非發(fā)酵革蘭氏陰性菌,專 性需氧菌,生長溫度范圍25-42°C,最適生長溫度為25-30°C,特別是該菌在4°C不生長而在 42°C可以