一種固相介質(zhì)選擇性提取短片段長(zhǎng)度dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開一種固相介質(zhì)選擇性提取短片段長(zhǎng)度DNA的方法，利用固相介質(zhì)從不同長(zhǎng)度的DNA混合溶液中選擇性提取片段長(zhǎng)度小于200 bp的短片段DNA，屬于生物技術(shù)的技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]DNA提取是分子生物學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作。隨著DNA分子技術(shù)在臨床疾病診斷、進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、血液質(zhì)量控制等領(lǐng)域基礎(chǔ)與應(yīng)用研究的逐漸深入。對(duì)DNA分子進(jìn)行選擇性提取特別是對(duì)小片段DNA (長(zhǎng)度小于200 bp)的選擇性提取已經(jīng)成為了 DNA分析技術(shù)應(yīng)用推廣的一個(gè)難題。
[0003]目前商業(yè)上應(yīng)用的提取DNA試劑盒主要是磁珠法，玻璃珠法等以二氧化硅為基質(zhì)，采用向體系中加入高濃度的鹽，通過鹽橋建立的靜電相互作實(shí)現(xiàn)DNA的吸附和脫附，從而達(dá)到提取純化DNA的目的。然而由于該種方法依靠的是間接的靜電相互作用力，它的提取效率只有70%左右，并且它對(duì)DNA的吸附?jīng)]有選擇性，另外對(duì)小片段DNA分子的吸附效果甚微。此外，研究者應(yīng)用氨基硅烷偶聯(lián)劑偶聯(lián)反應(yīng)，使得粒子在一定PH下帶有正電，應(yīng)用強(qiáng)直接靜電相互作用吸附DNA分子，然而，這種方法脫附很難實(shí)現(xiàn)，不能達(dá)到對(duì)DNA的有效提取及選擇性提取。而對(duì)于選擇性提取DNA方面，科學(xué)研究者已經(jīng)應(yīng)用單鏈DNA與雙鏈DNA帶電性質(zhì)的不同將單鏈DNA從兩者混合物中提取出來。但是目前對(duì)選擇性提取不同片段DNA分子尤其是選擇性提取小片段DNA仍沒有有效的措施。近年來，細(xì)胞外血漿中游離小片段DNA (cfDNA)越來越多的引起人們的重視，它的成功純化富集對(duì)非侵入性產(chǎn)前診測(cè)、惡性腫瘤早期診斷、癌癥治療過程檢測(cè)等臨床疾病診療過程具有重要意義。事實(shí)上，已經(jīng)有一些公司針對(duì)cfDNA提取的需求，通過對(duì)基因組DNA提取技術(shù)的優(yōu)化，推出了相關(guān)的提取試劑盒，這些試劑盒中采用硅膠膜作為提取介質(zhì)，對(duì)短片段DNA有較高的提取效率，但還無法實(shí)現(xiàn)對(duì)短片段DNA的優(yōu)勢(shì)提取和不同長(zhǎng)度DNA片段的均衡提取。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種固相介質(zhì)選擇性提取短片段長(zhǎng)度DNA的方法，利用固相介質(zhì)從不同長(zhǎng)度的DNA混合溶液中選擇性提取片段長(zhǎng)度小于200 bp的短片段DNA，提取效率達(dá)到90%。
[0005]本發(fā)明所述的一種固相介質(zhì)選擇性提取短片段長(zhǎng)度DNA的方法，包括如下步驟: 將通過表面修飾后具有表面電荷反轉(zhuǎn)能力的固相介質(zhì)加入到含片段長(zhǎng)度小于200 bp
DNA的混合長(zhǎng)度DNA溶液中，使溶液中固相介質(zhì)的濃度為5 mg/ml。利用氯化鈉調(diào)節(jié)體系Na+濃度至0.1-0.5 mol/L之間；調(diào)節(jié)混合溶液pH在3.0-5.5之間；將混合溶液搖床震蕩30分鐘后，采用離心分離的方式除去固相介質(zhì)；向上清液中再加入固相介質(zhì)，利用氯化鈉調(diào)節(jié)體系Na+濃度至0.7-1.0 mol/L之間，將混合溶液搖床震蕩30分鐘，采用離心分離方式，將吸附了 DNA的固相介質(zhì)和溶液分離；將離心分離的固相介質(zhì)加入水中，調(diào)節(jié)pH在10.0-11.0之間，搖床震蕩30分鐘，采用離心分離的方式除去固相介質(zhì)，獲得含片段長(zhǎng)度小于200 bp的DNA溶液。
[0006]所述的固相提取介質(zhì)，可以為表面修飾了賴氨酸的硅藻土、玻璃珠、無定型二氧化硅微粒、介孔二氧化硅微粒、無定型氧化硅包覆磁性微?；蚪榭籽趸璋泊判晕⒘５娜我庖环N。
[0007]所述的含片段長(zhǎng)度小于200 bp DNA的混合長(zhǎng)度DNA溶液，其包含的其他DNA分子片段長(zhǎng)度要大于400 bp ;所述方法適用的DNA混合溶液不包括僅包含200 bp以下DNA與200-400 bp DNA的混合溶液。
[0008]本發(fā)明的積極效果在于:
將利用硅烷偶聯(lián)試劑在表面同時(shí)修飾氨基和羧基的固相介質(zhì)和不同片段長(zhǎng)度的DNA分子混合。通過對(duì)固相介質(zhì)進(jìn)行表面修飾，使介質(zhì)隨著PH值的變化具備電荷反轉(zhuǎn)特性，通過加入一定濃度的鹽溶液使得不同片段DNA具有的電荷量不同，從而通過靜電相互作用選擇性吸附特定長(zhǎng)度片段的DNA分子，達(dá)到高效提取，選擇性提取的目的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:對(duì)DNA具有高的吸附效率和脫附效率，總提取效率高于95%，對(duì)短片段DNA分子，選擇性分離效率高于90%，所用試劑簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，操作快速便捷。
【附圖說明】
[0009]圖1為DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖中，I道為marker，2道為混合DNA，3道為提取后DNA，4道為提取后殘留DNA。
[0010]【具體實(shí)施方式】:
借助以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，應(yīng)理解，以下實(shí)施例是示范性的，而不是限制性的，可根據(jù)上述發(fā)明的技術(shù)方案和實(shí)際情況，來確定具體的實(shí)施方法。
[0011]本發(fā)明中所述的DNA吸附率，是固相介質(zhì)吸附的DNA質(zhì)量與原溶液中DNA總質(zhì)量的比值。不同長(zhǎng)度片段DNA選擇性吸附效率是通過瓊脂糖凝膠電泳圖像軟件定量得到。
[0012]實(shí)施例1:
將0.5 mg表面賴氨酸修飾的硅藻土微粒分散在100 μ I含有500 bp DNA和100 bp線性雙鏈DNA分子(濃度各為25 ng/ μ I)的水溶液中，用氯化鈉調(diào)節(jié)體系中Na+濃度為0.4mol/L。調(diào)節(jié)溶液pH值為5.0，混勾后搖床震蕩30分鐘。用6000 rpm離心分出娃藻土粒子。另取1.0 mg表面賴氨酸修飾的硅藻土微粒分散在上述離心后上清溶液中，用氯化鈉調(diào)節(jié)體系中Na+濃度為0.8 mol/L。溶液pH值調(diào)節(jié)為5.0?；靹蚝髶u床震蕩30分鐘，用6000rpm離心分出娃藻土微粒，除去上清液。向分出的娃藻土粒子中加入150 μ I 7K，調(diào)節(jié)pH為10.0，混勻后搖床震蕩20分鐘，離心6000rpm除去硅藻土顆粒，得到含有100 bp DNA的水溶液。利用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合定量軟件可知選擇性提取100 bp DNA的效率可達(dá)到97%。DNA瓊脂糖凝膠電泳圖參見圖1，I道為marker，2道為混合DNA，3道為提取后DNA，4道為提取后殘留DNA。
[0013]實(shí)施例2:
將0.5 mg表面賴氨酸修飾的硅藻土微粒分散在100 μ I含有鮭魚精DNA (DNA片段長(zhǎng)度大于1000 bp)和100 bp DNA分子(濃度各為25 ng/μ I)的水溶液中，用氯化鈉調(diào)節(jié)體系中Na+濃度為0.3 mol/L。調(diào)節(jié)溶液pH值為5.0，混勻后搖床震蕩30分鐘。用6000 rpm離心分出娃藻土粒子。另取1.0 mg表面賴氨酸修飾的娃藻土微粒分散在上述離心后上清溶液中，用氯化鈉調(diào)節(jié)體系中Na+濃度為1.0 mol/L。溶液pH值調(diào)節(jié)為5.0。混勻后搖床震蕩30分鐘，用6000 rpm離心分出娃藻土微粒，除去上清液。向分出的娃藻土粒子中加入150 μ I 7Κ，調(diào)節(jié)pH為10.