0k) :5-GACTGCGTACCAATTC-3， [SEQ ID 45]
[0339] 93E40(M00k) :5-GATGAGTCCTGAGTAA-3， [SEQ ID 46]
[0340] PCR擴(kuò)增之后，PCR產(chǎn)物純化和MegaBACElOOO中的檢測如van Ei jk和同事（vide supra)描述的。獲自PSP11、PI201234和8RIL后代的擴(kuò)增產(chǎn)物的偽-凝膠成像（pseudo-gel image)如圖8B所示。
[0341] SNPWave的結(jié)果清楚地表示A/G SNP通過SNPWave分析檢測，得到關(guān)于PI (PSP11) 和RIL 1、2、3、4、6和7代）的92bp產(chǎn)物（ = AA純合子基因型），和關(guān)于P2(PI201233)和 RIL 5和8代的94bp產(chǎn)物（=GG純合子基因型）。
[0342] 實(shí)施例7 :用于富集針對低拷貝序列的AFLP片段文庫的策略
[0343] 為了增加如實(shí)施例4中描述的優(yōu)良的多態(tài)性的數(shù)量，該實(shí)施例描述了幾個針對 獨(dú)特的基因組序列的目標(biāo)低拷貝的富集方法。所述方法可以分為4類：
[0344] 1)針對制備高質(zhì)量基因組DNA (葉綠體序列除外）的方法。
[0345] 這里提出，制備核DNA代替實(shí)施例4中所述的完整基因組DNA，排除大量葉綠 體DNA共分離物，其可以使植物基因組DNA序列數(shù)量減少，依靠在片段文庫制備方法中使 用的限制性核酸內(nèi)切酶和選擇性AFLP引物。用于高純度番茄核DNA分離的方法已經(jīng)由 Peterson, DG.，Boehm, K. S. &Stack S. M. (1997)描述。Isolation of Milligram Quantities of Nuclear DNA From Tomato(Lycopersicon esculentum),A Plant Containing High Levels of Polyphenolic Compounds. Plant Molecular Biology Reporter 15 (2), pagesl48_153。
[0346] 2)針對在AFLP模板制備過程中使用限制性核酸內(nèi)切酶的方法，其被期望可以使 低拷貝序列的水平提高
[0347] 在此提出，在AFLP模板制備過程中，用某種限制性核酸內(nèi)切酶，其期望針對于低 拷貝或獨(dú)特的基因組序列，以得到關(guān)于多態(tài)性的富集的片段文庫，其具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)換為基因 分型分析的能力。針對植物基因組中低拷貝序列的限制性核酸內(nèi)切酶的例子為PstI。優(yōu)選 地，其他甲基化敏感性限制性核酸內(nèi)切酶也可以針對低拷貝或獨(dú)特的基因組序列。
[0348] 3)基于相對于低拷貝序列的重復(fù)序列的重退火動力學(xué)的選擇性去除高重復(fù)的序 列的方法
[0349] 在此提出，在選擇性擴(kuò)增之前，選擇性地去除來自各個完整基因組DNA樣品或來 自（cDNA-) AFLP模板材料的高復(fù)制的（重復(fù)）序列。
[0350] 3a)高一 CJ DNA制備是一種一般用于富集來自復(fù)雜植物基因組DNA混合物的慢 退火的低拷貝序列的方法（Yuan 等人 2003 ;High_Cot sequence analysis of the maize genome. Plant J. 34:249-255)。其表示用高-CJ而非完整基因組DNA作為起始材料用于 富集定位于低拷貝序列中的多態(tài)性。
[0351] 3b)替代費(fèi)力的高一 CJ制備，可以將變性且重退火的dsDNA，與新的來自 Kamchatka crab的核酸酶一起溫育，所述酶以相比于非優(yōu)選的配對的DNA雙鏈更快 的速度來消化短的、優(yōu)選配對的DNA雙鏈，如Zhulidov和其同事（2004 ;Simple cDNA normalization using Kamchatka crab duplex-specific nuclease. Nucleic Acids Research 32, e37)和 Shagin 和其同事（2006 ;a novel method for SNP detection using a new duplex-specific nuclease from crab hepatopancreas. Genome Research 12:1935-1942)所描述的4寺別地，建議AFLP限制性/連接混合物和這個核酸內(nèi)切酶溫育以 減少_度復(fù)制的序列的混合物，之后進(jìn)彳丁殘留的低拷貝或獨(dú)特的基因組序列的選擇性AFLP 擴(kuò)增。
[0352] 3c)甲基過濾是一種富集低甲基化的基因組DNA片段的方法，用限制性 核酸內(nèi)切酶McrBC，其切割甲基化DNA，在序列[A/G]C中，其中C被甲基化（參見 Pablo D. Rabinowicz, Robert Citek, Muhammad A.Budiman, Andrew Nunberg, Joseph A.Bedell, Nathan Lakey, Andrew L. 0'Shaughnessy, Lidia U. Nascimento, ff. Richard McCombie and Robert A. Martienssen. Differential methylation of genes and repeats in land plants. Genome Researchl5:1431-1440, 2005)。McrBC 可以用于富集作為用于多 態(tài)性發(fā)現(xiàn)的起始材料的基因組的低拷貝序列片段。
[0353] 4)為了得到目標(biāo)基因序列，使用相對于基因組DNA的cDNA
[0354] 最后，在此建議，作為相對于多態(tài)性發(fā)現(xiàn)的起始材料的基因組DNA使用 oligodT-引發(fā)的cDNA，任選的，組合使用在上述3b中所述的Crab雙鏈一特異核酸酶用于 標(biāo)準(zhǔn)化。注意使用oligodT引發(fā)的cDNA也把葉綠體序列排除在外?？蛇x擇地，cDNA-AFLP 模板替代oligodT-引發(fā)的cDNA用來在類似于AFLP的方法中促進(jìn)擴(kuò)增殘留的低拷貝序列 (也見于上文的3b)。
[0355] 實(shí)施例8 :用于單個序列重復(fù)富集的策略
[0356] 本實(shí)施例描述了建議的用于單個序列重復(fù)序列的發(fā)現(xiàn)的策略，類似于在實(shí)施例4 中所描述的SNP的發(fā)現(xiàn)。
[0357] 特別地，進(jìn)行兩種或多種樣品的基因組DNA的限制性一連接，例如，用限制性核酸 內(nèi)切酶Pstl/Msel。進(jìn)行如實(shí)施例4中所述的選擇性AFLP擴(kuò)增。之后，通過兩種方法中的 一種富集含有經(jīng)選擇的SSR基序的片段：
[0358] 1)對含有與目標(biāo)SSR基序（例如似)15如果富集CA/GT重復(fù)）匹配的寡核 苷酸的過濾物Southern blot雜交，之后擴(kuò)增結(jié)合片段，以如Armour和其同事（Armo ur, J. , Sismani, C. , Patsalis, P. , and Cross, G. (2000)Measurement of locus copy number by hybridization with amplifiable probes. Nucleic Acids Research vol 28, no. 2, pp. 605-609)所描述的類似的方式；或通過
[0359] 2)使用生物素化的捕獲寡核苷酸雜交探針以捕獲溶液中的（AFLP)片段的富集， 如Kijas和其同事所述（Kijas，J.M, ? Fowler, J.C，Garbe1:t CA.，and Thomas，M.R.，（1994). Enrichment of microsatellites from the citrus genome using biotinylated oligonucleotide sequences bound to streptavidin-coated magnetic particles.Biot echniques, vol. 16, pp. 656-662.
[0360] 之后，SSR基序富集的AFLP片段用與預(yù)擴(kuò)增步驟中使用的相同的AFLP引物擴(kuò)增， 以產(chǎn)生序列文庫。擴(kuò)增片段的等分（aliqout)為克隆的T/A和96克隆測序以評估陽性克 隆的部分（含有目的SSR基序的克隆，例如，大于5個重復(fù)單元的CA/GT基序）。富集的 AFLP片段混合物的另一個等分測試樣品通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)檢測，任選的，之 前進(jìn)一步進(jìn)行選擇性擴(kuò)增以獲得可讀的指紋，以此來可視化檢查含有SSR的片段是否被富 集。成功完成這些控制步驟后，序列文庫進(jìn)彳丁尚通量454測序。
[0361] 上述用于從頭SSR發(fā)現(xiàn)的策略在圖8A中示意性描述，并且可以通過相應(yīng)地替換捕 獲寡核苷酸序列從而適用于其他基序。
[0362] 實(shí)施例9用于避免混合的標(biāo)簽的策略
[0363] 混合的標(biāo)簽指的是這一現(xiàn)象，每個樣品除了期望的加標(biāo)簽的AFLP引物組合外，還 觀察到少量的序列級分，其在一個末端含有樣品1標(biāo)簽，并且在另一個末端含有樣品2標(biāo)簽 (見實(shí)施例4中的表1)。示意性地，含有混合的標(biāo)簽的序列的結(jié)構(gòu)如下列所描述的。
[0364] 代表期望的樣品標(biāo)簽組合的示意圖
[0365] EcoRI tag Msel tag
[0366] PSP 11 ：5r -CGTC-------------------------------------------ACCA-3'
[0367] 3r -GCAG--------------------------------------------TGGT-5'
[0368] PI-2012345'-CAAG---------------------------------------GGCT-3'
[0369] 3r -GTTC---------------------------------------CCGA-5'
[0370] 代表混合的標(biāo)簽的示意圖
[0371] EcoRI tag Msel tag
[0372] 5，-CGTC------------------------------------------GGCT-3'
[0373] 3，-GCAG-------------------------------------------CCGA-5'
[0374] 5，-CAAG------------------------------------------ACCA-3'
[0375] 3'-GTTC-----------------------------------------TGGT-5 '
[0376] 觀察到的混合的標(biāo)簽妨礙了 PSP11或PI-201234的序列的正確指定。
[0377] 胡椒測序中觀察到的混合的標(biāo)簽序列的例子在實(shí)施例4中描述，如圖5A所示。觀 察到的含有預(yù)料到的標(biāo)簽和混合的標(biāo)簽的片段的整體情況示于圖5A的圖示2中。
[0378] 關(guān)于混合的標(biāo)簽的提出的分子解釋為在序列文庫制備步驟中，在接頭連接之前， 用T4DNA聚合酶或Klenow使DNA片段變?yōu)槠侥┒艘匀コ?引物突出端（Margulies等人， 2005)。處理單個的DNA樣品時，能夠很好地完成這一操作，但是如果用兩個或多個樣品加 不同標(biāo)簽的DNA樣品的混合物通過聚合酶來填充的時候，結(jié)果當(dāng)在衍生自不同樣品的互補(bǔ) 鏈之間形成異源雙鏈核酸分子時，引入了錯誤的標(biāo)簽序列（圖5B圖示3混合的標(biāo)簽）。發(fā) 現(xiàn)在454序列文庫構(gòu)建中接頭連接后的純化步驟后富集樣品的解決方法，如圖5C圖示4所 不。
[0379] 實(shí)施例10使用454序列文庫制備的改良設(shè)計來避免混合的標(biāo)簽和串聯(lián)體的策略
[0380] 除了觀察到如實(shí)施例9所述的含有混合的標(biāo)簽的序列讀取以外，還觀察到了低 頻率串聯(lián)的AFLP片段的序列讀取。
[0381] 衍生自串聯(lián)體的序列讀取的例子描述于圖6A圖示1中。示意性地，含有期望的標(biāo) 簽和串聯(lián)體的序列的結(jié)構(gòu)描述于圖6A圖示2中。
[0382] 關(guān)于串聯(lián)的AFLP片段的發(fā)生而提出的分子解釋是：454序列文庫制備步驟中，在 接頭連接之前（Margulies et al.，2005)，DNA片段用T4DNA聚合酶或Klenow酶使其為平 末端，以除去3引物突出端。結(jié)果，在連接步驟中，平末端樣品DNA片段與接頭競爭，并且在 被連接到接頭之前可以相互連接。這一現(xiàn)象事實(shí)上不依賴于是否文庫制備步驟中包括的是 單個DNA樣品或是多個（加標(biāo)簽的）樣品的混合物，并且因此也可以在常規(guī)測序方法，如 Margulies和其同事所描述的方法中發(fā)生。如果使用如實(shí)施例4中所述的多個加標(biāo)簽的樣 品，串聯(lián)體復(fù)雜化了對基于標(biāo)記信息的樣品的序列讀取的正確指定，并且因此應(yīng)予消除。
[0383] 對串聯(lián)體（和混合的標(biāo)簽）形成所提出的方法是用含有3引發(fā)T突出端的接頭的 連接取代平末端接頭連接，類似于PCR產(chǎn)物的T/A克隆，如圖6B圖示3所述。方便地，建議 在這些經(jīng)修飾的含3'引發(fā)T突出端的接頭在相對的3'末端含有C突出端（其不能與樣品 DNA片段連接，防止接頭序列的平末端串聯(lián)體形成（見圖6B圖示3)。使用經(jīng)修飾的接頭的 方法時，最終的序列文庫構(gòu)建方法的適當(dāng)?shù)牧鞒淌疽庑缘孛枋鲇趫D6C圖示4中。
【主權(quán)項】
1. 具有3' -T突出端的接頭在減少擴(kuò)增的DNA樣品的混合加標(biāo)簽的方法中的用途，其 中所述擴(kuò)增的DNA樣品包括通過復(fù)雜度降低獲得的具有3'-T突出端的擴(kuò)增的片段，所述方 法不是用于疾病診斷的方法。2. 權(quán)利要求1的用途，其中用于減少擴(kuò)增的DNA的混合加標(biāo)簽的方法包括下列步驟： -提供DNA樣品， -用加標(biāo)簽的擴(kuò)增引物擴(kuò)增DNA樣品來生成加標(biāo)簽的擴(kuò)增子， -任選的，提供3' -A突出端到加標(biāo)簽的擴(kuò)增子的末端， -將具有3' -T突出端的接頭與加標(biāo)簽的擴(kuò)增子連接。3. 權(quán)利要求2的用途，其中所述接頭連接的片段或擴(kuò)增子在固相支持物上接受測序。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于高通量鑒定單核苷酸多態(tài)性的方法，該方法通過對兩個或多個樣本進(jìn)行復(fù)雜度降低以生成兩個或多個文庫，對所述文庫的至少部分進(jìn)行測序，比對經(jīng)鑒定的序列并且測定任一假定的單核苷酸多態(tài)性，確認(rèn)任一假定的單核苷酸多態(tài)性，產(chǎn)生用于確認(rèn)單核苷酸多態(tài)性的檢測探針，對測試樣品進(jìn)行相同的復(fù)雜度降低以提供測試文庫并用檢測探針篩選該測試文庫，以檢測單核苷酸多態(tài)性存在或缺失。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/10
【公開號】CN105039313
【申請?zhí)枴緾N201510522246
【發(fā)明人】M·J·T·范艾克, H·J·A·范德珀爾
【申請人】科因股份有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2006年6月23日