產(chǎn)3-羥基丙酸均聚物/共聚物的重組菌及構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及一種用于生產(chǎn)3-羥基丙酸均聚物和/或3-羥基 丙酸共聚物的重組菌及其構建方法與應用。
【背景技術】
[0002] 利用代謝工程技術改造微生物已成為一種行之有效的方法來生產(chǎn)化學產(chǎn)品以及 新型的生物材料。聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates或PHA)是一類在微生物細胞 內(nèi)合成并積累而且具有生物可降解性和生物相容性的聚合物（SteinbUchel, A.，F(xiàn)uchtenb usch,B.,1998. Bacterial and other biological systems for polyester production. Trends Biotechnol. 16,419-427.)。隨著對其深入的研究，聚羥基脂肪酸酯在環(huán)保材料、 生物醫(yī)學和生物能源方面將極具應用價值（Chen GQ. A Polyhydroxyalkanoates Based Bi〇-and Materials Industry. Chem Soc Rev 38 (2009)2434 - 2446)〇
[0003] 根據(jù)單體的結構組成，PHA可分為短鏈和中長鏈兩類：前者的單體組成為碳鏈長 為C3到C5,后者的單體組成為C6到C14。
[0004] 3-羥基丙酸均聚物是目前開發(fā)的機械強度最高的生物可降解高分子聚合物，屬于 短鏈聚合物的一種，其優(yōu)越的理化性能將使其成為一種可廣泛應用的生物材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于生產(chǎn)3-羥基丙酸均聚物和/或3-羥基丙酸共聚物 的重組菌及其構建方法與應用。
[0006] 本發(fā)明所提供的方法可為利用葡萄糖合成由3-羥基丙酸和3-羥基丁酸組成的共 聚物的重組菌A的制備方法，具體可包括如下步驟：將甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因（gpd 基因）、三磷酸甘油磷酸酶的編碼基因（gpp基因）、甘油脫水酶1的編碼基因（dhaBl基因）、 甘油脫水酶2的編碼基因（dhaB2基因）、甘油脫水酶3的編碼基因（dhaB3基因）、甘油脫水 酶激活酶A的編碼基因（GdrA基因）、甘油脫水酶激活酶B的編碼基因（GdrB基因）、3_羥 基丙醛脫氫酶的編碼基因（pduP基因）、PHA聚合酶的編碼基因（phaC基因）、3_羥基丙酰 輔酶A連接酶的編碼基因（pcs'基因）、0 -酮基硫解酶的編碼基因（phaA基因）和NADPH 依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶的編碼基因（phaB基因）導入受體菌，得到重組菌A。
[0007]在本發(fā)明中，將所述甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因（gpd基因）、所述三磷酸甘油 磷酸酶的編碼基因（gpp基因）、所述甘油脫水酶1的編碼基因（dhaBl基因）、所述甘油脫 水酶2的編碼基因（dhaB2基因）、所述甘油脫水酶3的編碼基因（dhaB3基因）、所述甘油 脫水酶激活酶A的編碼基因（GdrA基因）、所述甘油脫水酶激活酶B的編碼基因（GdrB基 因）、所述3-羥基丙醛脫氫酶的編碼基因（pduP基因）、所述PHA聚合酶的編碼基因（phaC 基因）、所述3-羥基丙酰輔酶A連接酶的編碼基因（pcs'基因）、所述0 -酮基硫解酶的編 碼基因（phaA基因）和所述NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶的編碼基因（phaB基因） 導入受體菌，除所述PHA聚合酶的編碼基因（phaC基因）為兩次導入外，其余所有的編碼基 因均為單次導入。
[0008] 本發(fā)明所提供的方法也可為利用葡萄糖合成3-羥基丙酸均聚物的重組菌B的制 備方法，具體可包括如下步驟：將甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因（gpd基因）、三磷酸甘油磷 酸酶的編碼基因（gpp基因）、甘油脫水酶1的編碼基因（dhaBl基因）、甘油脫水酶2的編 碼基因（dhaB2基因）、甘油脫水酶3的編碼基因（dhaB3基因）、甘油脫水酶激活酶A的編 碼基因（GdrA基因）、甘油脫水酶激活酶B的編碼基因（GdrB基因）、3_羥基丙醛脫氫酶的 編碼基因（pduP基因）、PHA聚合酶的編碼基因（phaC基因）和3-羥基丙酰輔酶A連接酶 的編碼基因（pcs'基因）導入受體菌，得到重組菌B。
[0009] 在本發(fā)明中，將所述甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因（gpd基因）、所述三磷酸甘油 磷酸酶的編碼基因（gpp基因）、所述甘油脫水酶1的編碼基因（dhaBl基因）、所述甘油脫 水酶2的編碼基因（dhaB2基因）、所述甘油脫水酶3的編碼基因（dhaB3基因）、所述甘油 脫水酶激活酶A的編碼基因（GdrA基因）、所述甘油脫水酶激活酶B的編碼基因（GdrB基 因）、所述3-羥基丙醛脫氫酶的編碼基因（pduP基因）、所述PHA聚合酶的編碼基因（phaC 基因）和所述3-羥基丙酰輔酶A連接酶的編碼基因（pcs'基因）導入所述受體菌中，對于 每個編碼基因來說均為單次導入。
[0010] 本發(fā)明所提供的方法還可為利用葡萄糖合成3-羥基丙酸均聚物的重組菌C的制 備方法，具體可包括：
[0011] 將甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因（gpd基因）、三磷酸甘油磷酸酶的編碼基因（gpp 基因）、甘油脫水酶1的編碼基因（dhaBl基因）、甘油脫水酶2的編碼基因（dhaB2基因）、 甘油脫水酶3的編碼基因（dhaB3基因）、甘油脫水酶激活酶A的編碼基因（GdrA基因）、甘 油脫水酶激活酶B的編碼基因（GdrB基因）、PHA聚合酶的編碼基因（phaC基因）、3_羥基 丙酰輔酶A連接酶的編碼基因（pcs'基因）、醇脫氫酶的編碼基因（dhaT基因）和醛脫氫酶 的編碼基因（aldD基因）導入受體菌，得到重組菌C。
[0012] 在本發(fā)明中，將所述甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因（gpd基因）、所述三磷酸甘油 磷酸酶的編碼基因（gpp基因）、所述甘油脫水酶1的編碼基因（dhaBl基因）、所述甘油脫 水酶2的編碼基因（dhaB2基因）、所述甘油脫水酶3的編碼基因（dhaB3基因）、所述甘油 脫水酶激活酶A的編碼基因（GdrA基因）、所述甘油脫水酶激活酶B的編碼基因（GdrB基 因）、所述PHA聚合酶的編碼基因（phaC基因）、所述3-羥基丙酰輔酶A連接酶的編碼基因 (pcs'基因）、所述醇脫氫酶的編碼基因（dhaT基因）和所述醛脫氫酶的編碼基因（aldD基 因），對于每個編碼基因來說均為單次導入。
[0013] 前文涉及的各種酶的氨基酸序列如下：
[0014] 所述甘油三磷酸脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列13或保有功能的隨機或/ 和定點誘變序列；所述三磷酸甘油磷酸酶的氨基酸序列為序列表中序列14或保有功能的 隨機或/和定點誘變序列；所述甘油脫水酶1的氨基酸序列為序列表中序列15或保有功能 的隨機或/和定點誘變序列；所述甘油脫水酶2的氨基酸序列為序列表中序列16或保有功 能的隨機或/和定點誘變序列；所述甘油脫水酶3的氨基酸序列為序列表中序列17或保有 功能的隨機或/和定點誘變序列；所述甘油脫水酶激活酶A的氨基酸序列為序列表中序列 18或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述甘油脫水酶激活酶B的氨基酸序列為序列 表中序列19或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述3-羥基丙醛脫氫酶的氨基酸序 列為序列表中序列20或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述PHA聚合酶的氨基酸序 列為序列表中序列21或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述3-羥基丙酰輔酶A連 接酶的氨基酸序列為序列表中序列22或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述醇脫氫 酶的氨基酸序列為序列表中序列23或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述醛脫氫酶 的氨基酸序列為序列表中序列24或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述酮基硫 解酶的氨基酸序列為序列表中序列25或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述NADPH 依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶的氨基酸序列為序列表中序列26或保有功能的隨機或/和 定點誘變序列。
[0015] 進一步，前文涉及的各種酶的編碼基因的核苷酸序列如下：
[0016] 所述甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因（gpd基因）的核苷酸序列為序列表中序列1 或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述三磷酸甘油磷酸酶的編碼基因（gpp基因）的 核苷酸序列為序列表中序列2或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述甘油脫水酶1 的編碼基因（dhaBl基因）的核苷酸序列為序列表中序列3的第35-1702位或保有功能的 隨機或/和定點誘變序列；所述甘油脫水酶2的編碼基因（dhaB2基因）的核苷酸序列為序 列表中序列3的第1715-2299位或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述甘油脫水酶 3的編碼基因（dhaB3基因）的核苷酸序列為序列表中序列3的第2302-2727位或保有功能 的隨機或/和定點誘變序列；所述甘油脫水酶激活酶A的編碼基因（GdrA基因）的核苷酸 序列為序列表中序列4或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述甘油脫水酶激活酶B 的編碼基因（GdrB基因）的核苷酸序列為序列表中序列5或保有功能的隨機或/和定點誘 變序列；所述3-羥基丙醛脫氫酶的編碼基因（pduP基因）的核苷酸序列為序列表中序列6 或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述PHA聚合酶的編碼基因（phaC基因）的核苷 酸序列為序列表中序列7或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述3-羥基丙酰輔酶A 連接酶的編碼基因（pcs'基因）的核苷酸序列為序列表中序列8或保有功能的隨機或/和 定點誘變序列；所述醇脫氫酶的編碼基因（dhaT基因）的核苷酸序列為序列表中序列9或 保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述醛脫氫酶的編碼基因（aldD基因）的核苷酸序 列為序列表中序列10或保有功能的隨機或/和定點誘變序列；所述e-酮基硫解酶的編碼 基因（phaA基因）的核苷酸序列為序列表中序列11或保有功能的隨機或/和定點誘變序 列；所述NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶的編碼基因（phaB基因）的核苷酸序列為序 列表中序列12或保有功能的隨機或/和定點誘變序列。
[0017] 在以上提供的三種所述方法中，所述受體菌為革蘭氏陰性菌。所述革蘭氏陰 性菌可為大腸桿菌（Escherichia coli)、假單胞菌（Pseudomonas spp.)、嗜鹽單胞菌 (Halomonas spp.)、羅氏真養(yǎng)桿菌（Ralstonia eutropha)或氣生單胞菌（Aeromonas spp.) 等。這些菌自身含有能夠編碼具有三碳糖磷酸異構酶活性的蛋白的編碼基因（tpi基因）。
[0018] 在本發(fā)明中，所述受體菌具體為大腸桿菌Transl-Tl。
[0019] 在所述重組菌B的制備方法中，所述甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因（gpd基因）、 所述三磷酸甘油磷酸酶的編碼基因（gpp基因）、所述甘油脫水酶1的編碼基因（dhaBl基 因）、所述甘油脫水酶2的編碼基因（dhaB2基因）、所述甘油脫水酶3的編碼基因（dhaB3 基因）、所述甘油脫水酶激活酶A的編碼基因（GdrA基因）、所述甘油脫水酶激活酶B的編 碼基因（GdrB基因）、所述3-羥基丙醛脫氫酶的編碼基因（pduP基因）、所述PHA聚合酶的 編碼基因（phaC基因）和所述3-羥基丙酰輔酶A連接酶的編碼基因（pcs'基因）是以重 組表達載體A的形式導入所述受體菌中的。
[0020] 進一步，所述重組表達載體A為表達所述phaC基因、所述pcs'基因、所述dhaBl 基因、所述dhaB2基因、所述dhaB3基因、所述gpp基因、所述gpd基因、所述GdrA基因、所 述GdrB基因和所述pduP基因的載體。
[0021] 在所述重組菌C的制備方法中，所述甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因（gpd基因）、 所述三磷酸甘油磷酸酶的編碼基因（gpp基因）、所述甘油脫水酶1的編碼基因（dhaBl基 因）、所述甘油脫水酶2的編碼基因（dhaB2基因）、所述甘油脫水酶3的編碼基因（dhaB3 基因）、所述甘油脫水酶激活酶A的編碼基因（GdrA基因）、所述甘油脫水酶激活酶B的編 碼基因（GdrB基因）、所述PHA聚合酶的編碼基因（phaC基因）和所述3-羥基丙酰輔酶A 連接酶的編碼基因（pcs'基因）是以重組表達載體B的形式導入所述受體菌中的。所述醇 脫氫酶的編碼基因（dhaT基因）和所述醛脫氫酶的編碼基因（aldD基因）是通過重組表達 載體C的形式導入所述受體菌中的。
[0022] 進一步，所述重組表達載體B為表達所述phaC基因、所述pcs'基因、所述dhaBl 基因、所述dhaB2基因、所述dhaB3基因、所述gpp基因、所述gpd基因、所述GdrA基因、所 述GdrB基因的載體（pZQ03-dhaB-gpp-gpd-GdrAB載體）；所述重組表達載體C為pZQOl載 體。
[0023] 在所述重組菌A的制備方法中，所述甘油三磷酸脫氫酶的編碼基因（gpd基因）、三 磷酸甘油磷酸酶的編碼基因（gpp基因）、所述甘油脫水酶1的編碼基因（dhaBl基因）、所 述甘油脫水酶2的編碼基因（dhaB2基因）、所述甘油脫水酶3的編碼基因（dhaB3基因）、 所述甘油脫水酶激活酶A的編碼基因（GdrA基因）、所述甘油脫水酶激活酶B的編碼基因 (GdrB基因）、所述3-羥基丙醛脫氫酶的編碼基因（pduP基因）、所述PHA聚合酶的編碼基 因（phaC基因）和所述3-羥基丙酰輔酶A連接酶的編碼基因（pcs'基因）是以所述重組 表達載體A的形式導入所述受體菌中的。所述PHA聚合酶的編碼基因（phaC基因）、所述 0 _酮基硫解酶的編碼基因（phaA基因）和所述NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶的編 碼基因（phaB基因）是以重組表達載體D的形式導入所述受體菌中的。
[0024] 進一步，所述重組表達載體D為表達所述phaA基因、所述phaB基因和所述phaC 基因的載體。
[0025] 由以上所述的方法制備得到的所述重組菌A、所述重組菌B或所述重組菌C也屬于 本發(fā)明保護范圍。
[0026] 所述重組菌A在利用葡萄糖合成由3-羥基丙酸和3-羥基丁酸組成的共聚物中的 應用，以及所述重組菌B或所述重組菌C在利用葡萄糖合成3-羥基丙酸均聚物中的應用也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0027] 本發(fā)