一種青霉菌生產(chǎn)(s)-呋喃乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及到青霉菌細胞生物催化制備手性醫(yī)藥 中間體⑶_1-(呋喃-2-基)乙醇的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性⑶_1-(呋喃-2-基)乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農(nóng)藥品和其他特殊 材料的重要中間體。生物催化不對稱反應(yīng)具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等優(yōu)點,作為 綠色高效制備手性化合物的優(yōu)先途徑,被越來越多地應(yīng)用于生產(chǎn)一些高附加值的手性化 合物。生物催化制備手性(S)-l_(呋喃-2-基)乙醇具有很好的應(yīng)用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點,是可持續(xù) 發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機化學合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物 催化最具吸引力的應(yīng)用領(lǐng)域。在作為生物催化劑的六大類酶中,水解酶能夠催化動力學拆 分外消旋體得到手性產(chǎn)品,在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來,氧化還原 酶在工業(yè)上的應(yīng)用得到了迅速增長。目前,采用水解酶動力學拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學活性手性化合物的比例為4: 2:1。
[0004] 生物還原法相對于動力學拆分法而言,最大的優(yōu)勢在于理論收率可達100%,原子 經(jīng)濟性好。然而生物還原反應(yīng)需要輔酶或輔因子的參與,一定程度上限制了其應(yīng)用。由于 輔酶依賴性的緣故,生物還原反應(yīng)中多釆用整細胞作為催化劑,實現(xiàn)體內(nèi)輔酶循環(huán)再生的 同時免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (S)_l_(咲喃_2_基)乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農(nóng)藥品的重要手性砌 塊,?,F(xiàn)有的方法普遍存在轉(zhuǎn)化率低、反應(yīng)時間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴重缺陷, 難于進行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將采用生物細胞催化制備(s)-l_(呋喃-2-基)乙醇。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明采用青霉菌細胞催化制備(S)-l_(呋喃-2-基)乙醇,反應(yīng)式如下:
1-(呋喃-2-基)甲基酮(1)經(jīng)青霉菌催化反應(yīng),得到產(chǎn)物(S)-l_(呋喃-2-基)乙 醇(2)。有多種微生物可以催化此反應(yīng),經(jīng)過大量實驗篩選,最終確定采用青霉菌作為催化 劑,因為其催化反應(yīng)的效果最好,反應(yīng)收率、對映體過量率(ee%)均很高。
[0007] 許多青霉菌都可以進行生物催化此反應(yīng),然而,其效果不同,相差很大,經(jīng)實驗,本 發(fā)明選用青霉菌菌株為ATCC 201796,其催化反應(yīng)效果最佳。
[0008] 由于絕大多數(shù)氧化還原酶是輔酶NAD (P)H依賴型,而細胞本身所含有的輔酶量 可能較少,因此,進行氧化還原反應(yīng)時,為促進輔酶再生,提高反應(yīng)效率,在反應(yīng)體系中 還添加輔助底物構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系。常用的輔助底物種類較多,不同細胞所需的輔助底物不同, 效果差別很大,采用幾種輔助底物組合,可以取得較好效果,需進行大量實驗才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經(jīng)過大量實驗確定的輔助底物為:麥芽糖20-25g/L、異丙醇5-6%V/ V (體積濃度)。
[0009] 由于底物溶解度較低,所以,加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養(yǎng)介質(zhì): 1、種子培養(yǎng)基成份為:酵母提取物10 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,麥芽浸 膏25-30 g,硫酸銨0. 5-0. 7g/L,pH6. 9;配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0011] 2、培養(yǎng)液成份:玉米漿(以干物質(zhì)計)含量為35-45g/L,酵母浸膏8-10 g/L,葡 萄糖18-22 g/L,麥芽浸膏25-30 g,硫酸銨0. 5-0. 7g/L,硫酸鎂0. 3-0. 4g/L,磷酸二氧鉀 1. 8-2. 3g/L,碳酸鈣 0.7 g/L,硫酸亞鐵 0.18 g/L,硫酸錳 0.025 g/L;pH 5.0。
[0012] 2、固體培養(yǎng)基成份:在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0013] 青霉菌細胞制備。青霉菌經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液;發(fā)酵罐加入培養(yǎng) 液,121°C高壓滅菌30分鐘,冷卻至23-24°C,將青霉菌種子液接種至發(fā)酵罐,接種比例為 10-11%,通氣比為1. 1-1.4V/ (V分鐘),23-24°C培養(yǎng)35-40小時,用過濾式離心機離心得 到濕青霉菌細胞,用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0014] 生物催化轉(zhuǎn)化。底部通氣攪拌反應(yīng)罐中加入磷酸鹽緩沖液,pH為5.0,加入底物 1_(呋喃-2-基)甲基酮,使底物濃度為80-90 g/L。其他成份:玉米漿(以干物質(zhì)計)含 量為 12-15g/L,吐溫 80 ll-12g/L,麥芽糖 20-25g/L、異丙醇 5-6%V/V (體積濃度),121°C 高壓滅菌30分鐘;冷卻至28-29 °C時,加入濕青霉菌細胞使其濃度為8l-84g/L,通氣比為 0. 11-0. 13V/(V分鐘),進行生物催化反應(yīng),反應(yīng)時間為47-49小時;反應(yīng)結(jié)束后,濾出細胞, 用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液,蒸出乙酸乙酯,得到產(chǎn)物(S)-1-(呋喃-2-基)乙醇,反應(yīng)轉(zhuǎn)化率 98-99 %,產(chǎn)品收率96-97 %,對映體過量率98. 5-99 %。
[0015] 本發(fā)明所開展工作包括菌株選擇、催化反應(yīng)條件優(yōu)化(反應(yīng)溫度、通氣量、pH)、反 應(yīng)介質(zhì)選擇和濃度優(yōu)化,包括底物濃度、輔助底物組合、表面活性劑種類及濃度等。
[0016] 實施例1 種子培養(yǎng)基成份為:玉米漿(以干物質(zhì)計)含量為35-45g/L,酵母提取物10 g/L,葡 萄糖 20 g/L,硫酸銨 0? 5-0. 7g/L,硫酸鎂 0? 3-0. 4g/L,磷酸二氧鉀 1. 8-2. 3g/L,pH6. 9;配 制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0017] 玉米衆(zhòng)(以干物質(zhì)計)含量為35-45g/L,酵母浸膏8-10 g/L,葡萄糖18-22 g/ L,麥芽浸膏25-30 g,硫酸銨0. 5-0. 7g/L,硫酸鎂0. 3-0. 4g/L,磷酸二氧鉀1. 8-2. 3g/L,碳 酸鈣 0.7 g/L,硫酸亞鐵 0? 18 g/L,硫酸錳 0.025 g/L;pH 5.0。
[0018] 培養(yǎng)液成份為:玉米漿(以干物質(zhì)計)含量為35-45g/L,酵母浸膏8-10 g/L,葡 萄糖18-22 g/L,麥芽浸膏25-30 g,硫酸銨0. 5-0. 7g/L,硫酸鎂0. 3-0. 4g/L,磷酸二氧鉀 1. 8-2. 3g/L,碳酸鈣 0.7 g/L,硫酸亞鐵 0.18 g/L,硫酸錳 0.025 g/L;pH 5.0。
[0019] 濕青霉菌細胞制備過程如下:青霉菌ATCC 201796經(jīng)斜面、搖瓶培養(yǎng),得到種子 液。1L發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液;發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液,121°C高壓滅菌30分鐘,冷卻至23°C,將青 霉菌種子液接種至發(fā)酵罐,接種比例為接種比例為10-11 %,通氣比為1. 1VAV分鐘),23°C 培養(yǎng)35-40小時,用過濾式離心機離心得到濕青霉菌細胞,用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0020] 生物催化轉(zhuǎn)化:0. 5L底部通氣攪拌反應(yīng)器中加入磷酸鹽緩沖液,pH為5. 0,加入 底物1_(呋喃-2-基)甲基酮,使其濃度為80g/L,玉米漿(以干物質(zhì)計)含量為12g/L,吐 溫80 ll-12g/L,麥芽糖20-25g/L、異丙醇5-6%V/V (體積濃度),121°C高壓滅菌30分鐘; 冷卻至28-29°C時,加入濕青霉菌細胞使其濃度為81-84g/L,通氣比為0. 11-0. 13V/ (V分 鐘),進行生物催化反應(yīng),反應(yīng)時間為47-49小時;反應(yīng)結(jié)束后,濾出細胞,用乙酸乙酯萃取 反應(yīng)液,蒸出乙酸乙酯,得到產(chǎn)物(S)-1-(呋喃-2-基)乙醇,反應(yīng)轉(zhuǎn)化率99%,產(chǎn)品收率 97 %,對映體過量率98. 5 %。
[0021] 實施例2 種子培養(yǎng)基成份為:玉米漿(以干物質(zhì)計)含量為35-45g/L,酵母提取物10 g/L,葡 萄糖 20 g/L,硫酸銨 0? 5-0. 7g/L,硫酸鎂 0? 3-0. 4g/L,磷酸二氧鉀