膳食補充劑的制備
[0034] 1、材料與方法
[0035] 番茄汁蔗糖培養(yǎng)基的制備：成熟番茄清洗，去皮，榨汁機壓榨，100目紗布過濾取 汁，煮沸5min，8000g離心10min取上清液，加入質量百分比含量為15%的蔗糖加熱溶解后 冷卻至室溫，以食用級堿調節(jié)pH至6. 5,121°C滅菌20min，冷卻至室溫，即得無菌的番茄汁 蔗糖培養(yǎng)基。
[0036] 種子（發(fā)酵菌種）的制備：將保藏編號為CGMCC No.6431的檸檬明串珠菌 (Leuconostoc citreum)BD01707的凍干粉用少量無菌蒸餾水溶解，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于 蔗糖的質量百分比含量為2%的M17瓊脂培養(yǎng)基（購買自Merck Co.德國）上，28°C好氧 培養(yǎng)24h取出，用接種環(huán)挑取單菌落放入20mL蔗糖的質量百分比含量為2%的M17液體培 養(yǎng)基（購買自Merck Co.德國），28°C 180rpm搖床培養(yǎng)24h取出，培養(yǎng)物9,000rpm離心10 分鐘，棄去上清液，菌體用無菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無菌蒸餾水懸浮，得到 發(fā)酵用的種子。
[0037] 發(fā)酵液中多糖（果聚糖）的制備：取發(fā)酵液以4倍于發(fā)酵液體積的無菌水稀釋， 15, 000g離心10min，取上清液，加入3倍體積于上清液體積的無水乙醇，靜置過夜，15, 000g 離心10min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷凍干燥即得。
[0038]膳食補充劑中多糖（果聚糖）的制備：取膳食補充劑以無菌蒸餾水溶解，并還原至 冷凍干燥前的體積，緩慢加入3倍于該體積的無水乙醇，靜置過夜，15, OOOg離心10min，收 集沉淀物并溶于水后，真空冷凍干燥即得。
[0039] 2、富含果聚糖的膳食補充劑的制備
[0040] (1)將所得的檸檬明串珠菌BD01707種子以接種量2% (v/v)無菌接種于含蔗糖 15% (v/v)，pH為6. 5的番茄汁培養(yǎng)基，30°C、200rpm培養(yǎng)96小時，發(fā)酵結束后取發(fā)酵液， 經(jīng)測定，該發(fā)酵液中l(wèi)evan含量為2. 87% (w/v)。
[0041] (2)將發(fā)酵液8000g離心10min取上清液，pH調節(jié)至7. 0,冷凍干燥后得本實施例 的膳食補充劑A。
[0042] 經(jīng)檢測，本實施例生產(chǎn)的富含果聚糖的膳食補充劑中l(wèi)evan含量14. 87% (w/w)。
[0043] 3、成分檢測
[0044] (1)檸檬明串珠菌BD01707發(fā)酵液中多糖的單糖組成測定
[0045] (a)標準樣品配置：
[0046] 多糖水解：吸取100 y L濃度為4mg/mL~5mg/mL的多糖樣品溶液于5mL的具塞 刻度試管中，加入100 y L的4m〇L/LTFA，充N2封管，110°C烘箱中水解2h ;冷卻后打開蓋，加 200 y L甲醇后用N2吹干，如此重復加甲醇并用1吹3次，去除TFA，將其殘渣用水溶解定容 至5mL，用0. 45 y m微孔膜過濾后供進樣分析。
[0047] (b)色譜條件
[0048] 色譜柱：CarboPacPA203mmi. d. X 150mm ;
[0049] 流動相：A、H20 ;B、250mmol/L NaOH ;C、lmol/L NaAc ;
[0050] 三元梯度洗脫：流速：〇. 5mL/min ;積分脈沖安培檢測器；
[0051 ] Au工作電極：Ag/AgCl參比電極；
[0052] 進樣體積：20 y L ;柱溫：30°C。
[0053] (c)按前述方法制備的步驟（1)發(fā)酵液中的多糖樣品，并以高效陰離子色譜法測 定多糖的單糖組成。
[0054] 數(shù)據(jù)結果：檸檬明串珠菌BD01707多糖樣品糖基組成的色譜分析結果見圖1，該多 糖在14. 50min有單一吸收峰，且該吸收峰的保留時間與果糖標品保留時間一致。
[0055] 結論：檸檬明串珠菌BD01707多糖由果糖單一糖基組成，是一種果聚糖。
[0056] (2)檸檬明串珠菌BD01707發(fā)酵液中多糖的結構判定
[0057] (a)傅里葉紅外光譜（FTIR)測定
[0058] 將前述方法制備的步驟（1)發(fā)酵液中的多糖樣品與溴化鉀粉末充分混合后，壓制 成片狀，應用傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 6700, Thermo Fisher公司，美國）進行傅里葉紅 外光譜（FTIR)測定。
[0059] 結果如圖2所示，3306cm 1處的強寬峰為分子間及分子內(nèi)羥基吸收峰，2930cm 1和 2884cm 1為果糖殘基中C 一 H鍵伸縮振動的吸收峰，1634cm 1處的吸收峰是結合水所致， 1412 - 1217cm1為C 一 H變角振動的吸收峰，1120 - 1008cm 1處的吸收峰是C 一 0 - (：和 C 一 0 - H的伸縮振動的結果。923cm1和810cm 1處的吸收峰與呋喃環(huán)的伸縮振動有關。
[0060] 結論：BD01707多糖的糖環(huán)構型以呋喃環(huán)為主。
[0061] (b)核磁共振（NMR)測定
[0062] 將前述方法制備的步驟（1)發(fā)酵液中的多糖樣品按10mg/mL的濃度完全溶解于 重水中，并應用核磁共振波譜儀（Avance III 400MHz，Bruker公司，德國）進行核磁共振 (NMR)測定，結果如圖3所示。圖3中A為NMRjH譜，顯示樣品的七個質子的化學位移集中 在 3. 4 - 4. 2ppm 區(qū)域，而圖 3 中 B 為 NMR-13C 譜，顯示樣品在 104. 537 (C-2)，80. 622 (C-5)， 76. 628 (C-3)，75. 532 (C-4)，63. 716 (C-6)和 60. 234 (C-l) ppm 處有共振。
[0063] 結論：FTIR與1H、13C譜的數(shù)據(jù)結合分析表明，BD01707發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖為果聚 糖。
[0064] 實施例2富含果聚糖的膳食補充劑的制備
[0065] 1、材料與方法
[0066] 番茄汁蔗糖培養(yǎng)基的制備：成熟番茄清洗，去皮，榨汁機壓榨，100目紗布過濾取 汁，煮沸l(wèi)〇min，4000g離心12min取上清液，加入質量百分比含量為30%的蔗糖加熱溶解后 冷卻至室溫，以食用級堿調節(jié)pH至7. 5,135°C滅菌lOmin，冷卻至室溫，即得無菌的番茄汁 蔗糖培養(yǎng)基。
[0067] 種子（發(fā)酵菌種）的制備、發(fā)酵液中多糖（果聚糖）的制備、膳食補充劑中多糖 (果聚糖）的制備：同實施例1。
[0068] 2、富含果聚糖的膳食補充劑的制備
[0069] (1)將所得的檸檬明串珠菌BD01707種子以接種量0. 5% (v/v)無菌接種于蔗糖 的質量百分比含量為30%411為7.5的番茄汁培養(yǎng)基，35°(：、100印111培養(yǎng)120小時，發(fā)酵結 束后取發(fā)酵液，經(jīng)測定，該發(fā)酵液中l(wèi)evan的質量百分比含量為2. 36%。
[0070] (2)將發(fā)酵液4000g離心12min取上清液，pH調節(jié)至8. 0,冷凍干燥后得本實施例 的膳食補充劑B。
[0071] 經(jīng)檢測，本實施例生產(chǎn)的富含果聚糖的膳食補充劑中l(wèi)evan的質量百分比含量為 6. 88%。
[0072] 實施例3富含果聚糖的膳食補充劑的制備
[0073] 1、材料與方法
[0074] 番茄汁蔗糖培養(yǎng)基的制備：成熟番茄清洗，去皮，榨汁機壓榨，100目紗布過濾取 汁，煮沸l(wèi)min，12000g離心8min取上清液，加入質量百分比含量為5%的蔗糖加熱溶解后冷 卻至室溫，以食用級堿調節(jié)pH至5. 5,110°C滅菌30min，冷卻至室溫，即得無菌的番茄汁蔗 糖培養(yǎng)基。
[0075] 種子（發(fā)酵菌種）的制備、發(fā)酵液中多糖（果聚糖）的制備、膳食補充劑中多糖 (果聚糖）的制備：同實施例1。
[0076] 2、富含果聚糖的膳食補充劑的制備
[0077] (1)將所得的檸檬明串珠菌BD01707種子以接種量4. 0% (v/v)無菌接種于蔗糖 的質量百分比含量為5%，pH為5. 5的番茄汁培養(yǎng)基，20°C、300rpm培養(yǎng)72小時，發(fā)酵結束 后取發(fā)酵液，經(jīng)測定，該發(fā)酵液中l(wèi)evan的質量百分比含量為1. 88%。
[0078] (2)將發(fā)酵液12000g離心8min取上清液，pH