一種利用海洋紅酵母高產(chǎn)類胡蘿卜素和銅發(fā)酵培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株既能積累類胡蘿卜素又能富集銅的海洋紅酵母及其有利于類胡 蘿卜素積累的發(fā)酵培養(yǎng)方法，屬于海洋微生物的發(fā)酵及綜合利用技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 類胡蘿卜素是一類呈黃色、橙色或紅色的多烯類化合物，它是自然界中最普遍存 在也是最穩(wěn)定的天然色素，廣泛存在于許多動(dòng)植物中。類胡蘿卜素作為一種優(yōu)良的食品添 加劑和改善人類營(yíng)養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，它的優(yōu)良品質(zhì)和效果，很久以來(lái)就被世界各國(guó)所公認(rèn)， 被譽(yù)為最有希望的抗氧化劑。目前，類胡蘿卜素被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品及飼料添 加劑等行業(yè)中，由于其良好的應(yīng)用前景及卓越的功能，長(zhǎng)久以來(lái)倍受人們青睞。
[0003] 從天然食物提取類胡蘿卜素工藝復(fù)雜、成本高并且浪費(fèi)大量食物，因此通過(guò)微生 物發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素已成為研究熱點(diǎn)，特別是用不產(chǎn)生毒素的紅酵母作為菌種已被廣 泛研究。紅酵母是酵母菌中的一種，屬于隱形球酵母科，為單細(xì)胞真菌。紅酵母形體為卵圓 形或橢圓形，生殖方式為多邊形出芽生殖，能產(chǎn)生明顯的紅色或黃色色素。紅酵母能產(chǎn)生 胡蘿卜素、圓酵母素和紅酵母紅素等多種色素。
[0004] 銅是動(dòng)物必需的微量元素，對(duì)于動(dòng)物的健康和生長(zhǎng)都有很重要的作用。目前，已有 許多試驗(yàn)證實(shí)，在斷奶仔豬飼糧中以硫酸銅作為銅源添加（250mg/kg)的銅可以提高仔豬 的同采食量、日增重以及肉料比。但飼料中添加這種無(wú)機(jī)態(tài)的硫酸銅也存在很多問(wèn)題，如豬 吸收率低、與飼糧中其它組分配伍性差、排泄率高、污染環(huán)境等。但是，酵母菌具有鰲合銅粒 子的能力，它除了含有高含量和高吸收率的銅元素外，還具有良好穩(wěn)定性、與飼糧中其它組 分配伍性好、吸收率高、排泄率低、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 隨著對(duì)海洋微生物研究的加深，人們?cè)絹?lái)越重視海洋微生物的開(kāi)發(fā)價(jià)值。由于海 洋獨(dú)特的環(huán)境，例如高鹽、高壓、低營(yíng)養(yǎng)、低溫等，造就了海洋微生物有別于陸生微生物的許 多特異性。海洋紅酵母營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、菌體營(yíng)養(yǎng)豐富，有良好的開(kāi)發(fā)前景。
[0006] 張坤生《利用紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素及其功能性質(zhì)研究》公開(kāi)了以紅酵母 為出發(fā)菌株，利用二苯胺為篩選劑，通過(guò)紫外誘變，經(jīng)篩選得到一株高產(chǎn)類胡蘿卜素菌株 Ruv701，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到13. 25mg/L，5L罐發(fā)酵類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到37. 21mg/L，還公布 了通過(guò)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到促進(jìn)紅酵母發(fā)酵產(chǎn)生類胡蘿卜素的金屬離子的最佳添加量：K2S04 1. 0 %、MgS04 ? 7H20 0? 05 %、CuS04 ? 5H20 0? 0045%。
[0007] 發(fā)明專利申請(qǐng)CN104130952《一株膠紅酵母及其在發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素和油脂中 的應(yīng)用》公開(kāi)了一株膠紅酵母菌Rhodotorula mucilaginosa，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC No. 8926,還公開(kāi)了該菌株在pH4. 5-8. 0 均可以產(chǎn)生較高的類胡蘿卜素，但是最高產(chǎn)類胡蘿卜素范圍在PH6. 5-7. 5之間，葡萄糖和 蔗糖都可以作為產(chǎn)生類胡蘿卜素的碳源，但是以葡萄糖最好，碳氮比為25-35 : 1，溫度為 27-30°C之間，發(fā)酵96h類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，最高產(chǎn)量可達(dá)到22. 93mg/L。
[0008] 目前尚未有既能高產(chǎn)類胡蘿卜素又能富集銅的海洋紅酵母的相關(guān)報(bào)道，本發(fā)明以 期從海洋環(huán)境中分離獲得高產(chǎn)胡蘿卜素的富銅海洋紅酵母，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確 定適合于海洋紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的最優(yōu)培養(yǎng)條件，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)，探索一條 海洋紅酵母利用的新途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一株從海洋環(huán)境中分離獲得的既能高產(chǎn)類胡蘿卜素又能 富集銅的海洋紅酵母，并提供其能夠?qū)崿F(xiàn)高產(chǎn)胡蘿卜素并富集銅的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，為 工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
[0010] 本發(fā)明所述海洋紅酵母WYN1在含銅培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)能夠高效生產(chǎn)類胡蘿卜 素，具體的方法是：優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖1 %，酶解玉米粉1-3%，蛋白胨2. 5%， 硫酸鎂0. 02%，磷酸二氫鉀0. 15%，銅含量150-200mg/L，氯化鈉20%，其余為水；初始 pH為8,接種量3-8%，搖床轉(zhuǎn)速為50-80r/min，24-28°C培養(yǎng)10-15小時(shí)后調(diào)整溫度為 16-20°C進(jìn)行低溫靜止培養(yǎng)，停止攪拌，pH調(diào)整為3-5,保持2-4小時(shí)；之后階梯形升溫到 24-30°C，pH調(diào)整為4. 6-5. 5,按照2. 5%的添加量添加蛋白胨，按照2%的量添加酵母粉；搖 床轉(zhuǎn)速為50-100r/min，繼續(xù)發(fā)酵10-15h。
[0011] 優(yōu)選的，在低溫靜止培養(yǎng)階段向培養(yǎng)基中添加培養(yǎng)基重量3-5wt%的蛋氨酸螯和 銅。
[0012] 酶解玉米粉的制備方法為：取60g的玉米粉于1000mL三口燒瓶中，加入適量的去 離子水調(diào)制濃度為10%的料液，pH值調(diào)整至6. 0~6. 5。向料液中加入中溫a -淀粉酶，酶 用量為l〇-15U/g干物質(zhì)，50-55°C液化1. 5-2. 0h，升溫至90°C滅酶lOmin。再降溫至55°C， pH值調(diào)整為8. 0,加入堿性蛋白酶，酶用量為800-1000U/g干物質(zhì)，作用時(shí)間為2h，升溫滅酶 得酶解玉米粉液。
[0013] 本發(fā)明所述海洋紅酵母WYN1可廣泛應(yīng)用于食品添加劑工業(yè)，其發(fā)酵生產(chǎn)的類胡 蘿卜素作為一種優(yōu)良的食品添加劑和改善人類營(yíng)養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，可以被廣泛應(yīng)用于食 品、醫(yī)藥、化妝品中；另外該菌種還可以應(yīng)用于飼料工業(yè)中，作為飼料添加劑添加到飼料中， 可以提供B族維生素和銅離子，穩(wěn)定性好、與飼糧中其它組分配伍性好、吸收率高、排泄率 低、環(huán)境污染小，強(qiáng)化飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明從青島黃海海域海邊采集多種生物樣本，包括海蝦、海 星、海藻等，從中分離海洋紅酵母，并進(jìn)行該高產(chǎn)菌種積累類胡蘿卜素最優(yōu)條件優(yōu)化，工藝 流程包括：采集海洋生物樣本一海洋紅酵母分離、鑒定一影響類胡蘿卜素產(chǎn)量的單因素試 驗(yàn)、正交試驗(yàn)一銅離子馴化培養(yǎng)一最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件確定。
[0015] 本發(fā)明提供一株高產(chǎn)類胡蘿卜素的富銅海洋紅酵母WYN1，經(jīng)鑒定屬于紅酵母屬 (Rhodotorula)，所述菌株已于2014年11月25日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（地址： 中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072)，保藏編號(hào)為：CCTCC No :M 2014592,分類命名：海洋 紅酵母 WYN1 (Rhodotorula sp. WYN1) 〇
[0016] 有益效果：
[0017] 本發(fā)明利用從海洋環(huán)境中分離獲得一株高產(chǎn)胡蘿卜素的富銅海洋紅酵母WYN1， 通過(guò)靜止培養(yǎng)方法有效的提高了酵母中胡蘿卜素和銅產(chǎn)量。采用上述方法發(fā)酵培養(yǎng)海洋 紅酵母WYN1，其生物量、類胡蘿卜素產(chǎn)量及胞內(nèi)銅含量分別為27g/L以上、35-40mg/L和 7240-8000 yg/g 干菌。
[0018] 研發(fā)中，發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)低溫靜止培養(yǎng)可以有效提高胡蘿卜和銅含量。是本發(fā)明 的重要成果。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明方法。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù) 手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā) 明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背 離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改 動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 實(shí)施例1 :海洋紅酵母菌WYN1的獲得及耐銅能力馴化
[0021] (1)將從黃海海邊采集新鮮的海蝦、海星、海藻等生物樣本，置于無(wú)菌的YEro培養(yǎng) 基中，挑取紅色或粉紅色圓形菌落，進(jìn)一步純化培養(yǎng)。根據(jù)各菌種類胡蘿卜素的積累量，篩 選類胡蘿卜素產(chǎn)量高的菌種。其中類胡蘿卜素產(chǎn)量較高的海洋紅酵母WYN1，細(xì)胞為卵圓形， 沒(méi)有假菌絲；在海水配置的YEro培養(yǎng)基上形成紅色菌落，表面光滑，邊緣整齊；在產(chǎn)孢培養(yǎng) 基上不產(chǎn)子囊孢子，多邊芽殖，無(wú)擲孢子；不發(fā)酵糖，不形成類淀粉化合物，不同化肌醇。根 據(jù)上述特點(diǎn)，初步確定屬于紅酵母屬（Rhodotorula)。斜面保存于冰箱中。
[0022] (2)海洋紅酵母WYN1的發(fā)酵培養(yǎng)
[0023] 將菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上活化，28°C培養(yǎng)24h后，接種于液體種子培養(yǎng)基中， 28°(：振蕩培養(yǎng)3611得種子液，按10%接種量接入裝有6〇1^發(fā)酵培養(yǎng)基的25〇1^三角瓶中， 28°C，振蕩培養(yǎng)48h(搖床轉(zhuǎn)速為180r/min)。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2%，蛋白胨1%， 酵母膏1%，硫酸鎂〇. 02%，磷酸二氫鉀0. 15%，鹽度20。28°C搖床培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速為180r/ min〇
[0024] (3)耐銅能力馴化
[0025] 將海洋紅酵母菌WYN1接種于銅離子含量為50mg/L (硫酸銅配置）培養(yǎng)基中，置于 28°C，180r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)24h。然后從該培養(yǎng)物中取3ml發(fā)酵物接種到不含銅 的麥芽汁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h。反復(fù)培養(yǎng)幾代，使酵母在含銅的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)穩(wěn)定，且數(shù)量不 再增多時(shí)，再