檢測稻瘟病抗性與氮肥響應(yīng)的表達型分子標記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及稻瘟病相關(guān)研究領(lǐng)域，特別涉及一種檢測稻瘟病抗性與氮肥響應(yīng)的表 達型分子標記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氮素是植物主要的營養(yǎng)元素，對于正常生長發(fā)育必不可少，氮素的供應(yīng)水平對水 稻根系的生長形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)，尤其是對化學(xué)組成的影響最為明顯。已有研究表明，品種的 抗病性受氮肥量影響較大，氮肥量越多發(fā)病越重，增施氮肥顯著增加水稻葉瘟和穗頸瘟的 發(fā)生程度，尤其是抗瘟性往往首先出現(xiàn)在氮肥施用量大的稻田，雖然抗性喪失的程度和快 慢還受其它因素的影響，某些敏感品種，在高氮肥條件下，較其它品種更易喪失抗性，由于 抗病性降低，病菌種群數(shù)量增大，新小種較易被發(fā)現(xiàn)；另外，抗病性降低程度依小種而異，BP 某些小種在高氮肥條件下更易增值；再者，抗病性降低程度因品種-小種組合而異，即某些 組合在同一氮肥水平情況下，比其它組合更感病。許多研究學(xué)者都已注意到，稻瘟病的發(fā)生 及其嚴重程度與水稻植株中氮的含量有關(guān)。在環(huán)境因素相同的條件下，植株中氮含量越高， 稻瘟病病害越重。D. H. Long等通過兩年大田試驗，研究不同的氮肥水平和施氮方式對不同 水稻品種稻瘟病的影響認為，少量頻施氮肥可減少葉瘟的發(fā)生。任金平等的研究也發(fā)現(xiàn)，在 稻瘟病得到有效控制情況下，產(chǎn)量隨著施氮量的增加而提高，但在稻瘟病未得到有效控制 的情況下，隨著施氮量的增加，稻瘟病加重，產(chǎn)量降低。趙美琦等在研究水稻品種-稻瘟病 小種相對寄生適度時注意到：氮肥施用量對水稻各品種與稻瘟菌小種組合的接種發(fā)病程度 影響很大。
[0003] 現(xiàn)有研究表明，稻瘟病的發(fā)生及其嚴重程度與水稻植株中氮的含量有關(guān)?？赡苁?由于大量施氮促進植物生長，幼嫩組織增加，細胞壁變薄和強度下降，從而減低作物的抗 性，增加感病幾率，從生理上看可能是由于施氮增加了質(zhì)外體中氨基酸、酰胺的濃度，酶活 性和木質(zhì)素含量降低所致。缺氮植物的分類化合物含量通常很高，當大量供應(yīng)氮素時，酚 代謝的一些關(guān)鍵酶活性下降，酚含量和抗稻瘟病的能力就降低。水稻稻瘟病隨施氮水平的 增加而增加，可能與具有顯著抗稻瘟病病菌特性的酚類化合物和黃酮類物質(zhì)的含量下降有 關(guān)。隨著氮肥用量的增加，植物體內(nèi)糖類、淀粉含量下降，大量使用氮肥使合成酚的關(guān)鍵酶 苯丙氨酸解氨酶和酪氨酸解氨酶活性降低，從而使植株總酚含量降低。在一定范圍內(nèi)，施氮 量增加，多酚氧化酶活性降低，抗病能力減弱，易遭受病蟲害侵襲]。
[0004]雖然目前對稻瘟病的發(fā)生與氮肥使用量之間關(guān)系的研究已經(jīng)很多。但是，目前尚 缺乏有效檢測水稻稻瘟病抗與性氮肥施用量之間關(guān)系的有效方法和手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測稻瘟病抗性與 氮肥響應(yīng)的表達型分子標記，可用于高效快速檢測氮肥的施用量對稻瘟病抗性的影響。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0007] -種檢測稻瘟病抗性與氮肥響應(yīng)的表達型分子標記，根據(jù)與氮誘導(dǎo)蛋白相關(guān)的基 因0s04g0379600序列設(shè)計了一種檢測稻瘟病抗性與氮肥響應(yīng)的表達型分子標記Mg-N-1， 該分子標記參考的0s04g0379600基因的DNA核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0008] 進一步的，以SEQID NO: 1序列為基礎(chǔ)，利用Primer design設(shè)計的跨一個內(nèi)含子 的特異分子標記Mg-N-1，Mg-N-1標記的正反引物序列為：
[0009]正向引物（5，-3'）GCTAATGGCACAACCTGACA
[0010]反向引物（5，-3'）TAGGAGTATGCTGGCCATGT。
[0011] 進一步的，上述基因及引物在檢測稻瘟病抗性與氮肥響應(yīng)的表達型方面的應(yīng)用。
[0012] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0013] 本發(fā)明一種檢測稻瘟病抗性與氮肥響應(yīng)的表達型分子標記，可用于高效快速檢測 氮肥的施用量對稻瘟病抗性的影響。
【附圖說明】
[0014] 圖1該基因表達的電泳圖。
[0015] 其中，1和2為用DNA樣品進行擴增的電泳圖，3和4為用cDNA樣品進行擴增的 電泳圖，M 為 ladder markerDL-2000,分子量標記從小到大為 100bp，250bp，500bp，750bp， lOOObp 和 2000bp。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明技術(shù)方案做進一步詳細描述：
[0017]1.樣品的采集及總RNA的提取
[0018] 當水稻生長至3. 5葉期時，用稻瘟病菌接種水稻，并在接種后的0h，12h，24h，36h 和48h采集樣品，將取下的樣品迅速放入液氮中，防止RNA降解；研磨樣品時將研缽置于冰 盒中用液氮將研缽冷卻后，取出液氮保存的樣品，用研棒將樣品磨細，研磨過程中要保證缽 內(nèi)的溫度，不斷向缽中加入液氮，待樣品磨細后，靜止片刻待樣品略干時，將磨好樣品立即 放入裝有l(wèi)ml TRAZ0L提取液的Eppendorf管中（樣品量約三小勺尖），并劇烈震蕩搖勻后 防入-20°C保存?zhèn)溆?，整個過程中要保持樣品不能被污染。
[0019] 將磨好的RNA樣品放于室溫下約5min，待溶解后提取RNA，其操作步驟如下：
[0020]1)將溶解的樣品于4°C，10, OOOrpm下離心10min，取上清轉(zhuǎn)移到無RNA酶的離心 管中。
[0021] 2)加入0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。
[0022] 3) 4°C，12, OOOrpm離心10min，取上層無色的水相（約500 y 1)轉(zhuǎn)移到新管。
[0023] 4)加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置10min。
[0024]5) 4°C，12, OOOrpm 離心 10min，棄上清。
[0025] 6)向沉淀中加入lml 75%乙醇（DEPC處理過的水配制）4°C，9,OOOrpm離心5min， 倒出液體，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出，室溫放置晾干，洗滌沉淀2次。棄上 清保留沉淀后加1ML 100%乙醇同條件離心。
[0026]加入50-100 y 1無RNase的水，反復(fù)吹打、混勻，待RNA充分溶解后，利用核酸蛋白 分析儀檢測RNA濃度。
[0027] 表1?供試材料
[0028]
[0029] 2. RNA樣品中DNA的消化及其純化
[0030] DNA的消化處理時各種試劑的使用量參照的是TAKARA RNase-Free DNase試劑說 明書，消化10 y g RNA樣品的體系為30 y 1，加入下列組分并用無RNase的水補足體積。具 體操作步驟如下：
[0031] 1)將表1中的試劑配好（此步驟在冰上完成），混合均勻后于37°C保溫30min，消 化 DNA。