直接采用dgge割膠條帶浸出液的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種DGGE割膠條帶所含rDNA片段的測序方 法，尤其是指直接采用DGGE割膠條帶浸出液的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DGGE(變性梯度凝膠電泳)是一項(xiàng)DNA指紋技術(shù)，它可以分離長度相同但序列不同 的DNA片段，目前已經(jīng)成為微生物菌群多樣性研究的重要手段。與微生物學(xué)傳統(tǒng)研究手段 相比，DGGE最大的特點(diǎn)在于它是以樣品的總DNA(或RNA)出發(fā)進(jìn)行研究的，因此能檢測到 生態(tài)體系中大量不可培養(yǎng)的微生物菌群。同時這項(xiàng)技術(shù)還具有可靠性強(qiáng)、重現(xiàn)性高、方便快 捷等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于土壤、動物腸道、水體等各種環(huán)境體系的微生物生態(tài)解析中。 DGGE技術(shù)通常和rDNA分子鑒定技術(shù)相結(jié)合用于將微生物菌群多樣性信息轉(zhuǎn)化為微生物菌 群結(jié)構(gòu)信息。DGGE技術(shù)用于研究微生物菌群結(jié)構(gòu)一般包含以下五個主要步驟：一是樣品總 DNA或者總RNA提??；二是rDNA片段擴(kuò)增；三是擴(kuò)增片段的DGGE分離；四是DGGE圖譜分析 和條帶的割膠回收、再擴(kuò)增及測序；五是將測得的rDNA序列在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索來 判定對應(yīng)微生物的種屬信息。
[0003] 通過DGGE技術(shù)獲取所研究生態(tài)體系中微生物的種屬信息，其關(guān)鍵在于DGGE割膠 條帶所含rDNA片段的序列測定。然而大量研究和實(shí)踐表明，以DGGE割膠條帶的浸出液為 模板重?cái)U(kuò)增的rDNA片段（即使采用的是高保真的DNA聚合酶)，理論上應(yīng)該是單一的產(chǎn)物， 結(jié)果再次進(jìn)行DGGE時發(fā)現(xiàn)除了割膠條帶外還會出現(xiàn)多條原DGGE中的條帶和\或背景條 帶(非特異性條帶、片段拖尾和上樣孔條帶等)。由此可知，DGGE割膠條帶浸出液的PCR產(chǎn) 物往往并不是單一的而是混雜的。究其原因在于，DGGE用于微生物生態(tài)學(xué)研究時本身分析 的就是混雜的rDNA片段，這些擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)際上是非常復(fù)雜的，會有少量非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物 和異源雜交雙鏈等PCR人工產(chǎn)物以及其它擴(kuò)增產(chǎn)生的背景產(chǎn)物，這些非目標(biāo)產(chǎn)物將會遍及 DGGE膠的各個位置。因此，即使是在DGGE膠的空白處割膠，其浸出液也可以擴(kuò)增出微弱的 產(chǎn)物。主條帶是核酸片段集中的區(qū)域，更加會面臨所述樣品擴(kuò)增過程形成的非目標(biāo)產(chǎn)物的 影響。除了DGGE方法自身的原因外，電泳和割膠操作等過程也會引入污染，因?yàn)檫@些過程 本身就處于一個污染的環(huán)境中。比如實(shí)際過程中，電泳緩沖液無法做到每次一換(需要多達(dá) 7L的1XTAE緩沖液)，緩沖液本身就含有一定量的核酸背景；割膠時無法做到每個條帶一 把割膠刀，如果沒有徹底清除，上一個割膠條帶可能會殘留在割膠刀上污染后續(xù)的條帶。綜 上所述，割膠得到的DGGE條帶難免會混雜其它序列的片段尤其是其它DGGE主條帶，因此其 浸出液的PCR產(chǎn)物中往往含有較復(fù)雜的背景產(chǎn)物甚至是多種擴(kuò)增產(chǎn)物，導(dǎo)致二次DGGE出現(xiàn) 多條條帶和背景雜帶。如果將這樣的PCR產(chǎn)物直接送去測序的話，雖然很簡便，然而將導(dǎo)致 得到的序列是不準(zhǔn)確的(測序圖譜極易出現(xiàn)雙峰和套峰等異常現(xiàn)象）甚至測序失敗，從而影 響到所割DGGE條帶對應(yīng)的微生物種屬的分子鑒定結(jié)果。
[0004] 對于DGGE割膠條帶所含片段序列的測定，目前通常采取克隆測序的策略(詳見圖 1)。往裝有DGGE割膠條帶的無菌離心管中加入100ul無菌水，以浸出液為模板擴(kuò)增目標(biāo)片 段，將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到工程菌(如A cWi DH5a )中，然后對克隆片段進(jìn)行擴(kuò)增，挑 選和原始樣品條帶一致的克隆子，將該克隆子的擴(kuò)增片段送去測序，測定的序列在NCBI上 利用數(shù)據(jù)庫和軟件比對進(jìn)行種屬的分子鑒定。由于大量復(fù)制增殖后每個大腸桿菌細(xì)胞內(nèi) 只含有單一的克隆片段，因此利用克隆的方式可以將混合多種序列的片段分離，最終再利 用DGGE通過條帶位置進(jìn)行篩選。克隆測序策略(通常采用TA克隆方式）雖然解決了 DGGE 割膠條帶的測序問題，然而該策略需要進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增和純化、目標(biāo)片段和T載體連接、 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備、重組載體轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)和藍(lán)白篩選、同一 DGGE條帶位置克隆子篩 選、以克隆子為模板擴(kuò)增目標(biāo)片段并測序等諸多繁瑣和復(fù)雜的操作和步驟。以20條DGGE 條帶的分析為例，一整個克隆測序在測序前至少需要花費(fèi)一周的時間。成本方面，單看T載 體和感受態(tài)細(xì)胞，其商業(yè)化產(chǎn)品價格分別約為20元/次和30元/次，因此總成本不會少于 2000元。此外，對實(shí)驗(yàn)技能和操作要求很高，實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度大。
[0005]通過上述分析可知對于DGGE割膠條帶的序列測定，采用克隆測序的策略其成本、 時間和操作代價很大?？紤]到DGGE割膠割的是單一的條帶，浸出液中含有的主要是該條帶 對應(yīng)的片段，而混雜的其它片段是少量的；因此可以直接對DGGE割膠條帶的浸出液進(jìn)行處 理，消除混雜的少量其它片段，之后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增則將只得到一種擴(kuò)增產(chǎn)物，從而尋求一 種快速、簡便和經(jīng)濟(jì)的方法以使DGGE割膠條帶的PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)行測序分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服DGGE割膠條帶浸出液的PCR產(chǎn)物往往含有目標(biāo)片段外的背景產(chǎn)物，導(dǎo)致 直接測序不準(zhǔn)確甚至失敗的不足；本發(fā)明提供了一種DGGE割膠條帶浸出液的處理方法，它 可以消除目標(biāo)片段中混雜的其它片段，使得處理后浸出液的PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)行測序。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下： 本發(fā)明方法直接對DGGE割膠條帶的浸出液進(jìn)行處理：先利用變性退火過程使得少量 的污染片段中的大部分和大量的目標(biāo)片段形成異源雜交雙鏈，然后采用錯配酶切除形成的 異源雜交雙鏈，這樣就可以有效消除混雜的其它片段，同時目標(biāo)片段含量并未受大的損失。 由于模板得到凈化其擴(kuò)增將得到單一的PCR產(chǎn)物，就可以直接進(jìn)行測序。
[0008]本發(fā)明包括以下步驟： (1) DGGE膠經(jīng)EB染色后用滅菌刀片切下所需的條帶，挑到1.5ml無菌的離心管中，用 滅菌去離子水清洗數(shù)次，最終加入l〇〇ul滅菌去離子水后于-20°C冰箱中冷凍過夜； (2) 室溫融化（1)中的DGGE條帶浸出液，接著8000 rpm離心2min ;之后取10ul上清 液到無菌PCR管中，放到PCR儀中進(jìn)行變性退火操作，程序?yàn)椋合?5°C保溫5min，再65°C保 溫 15min，最后 25°C保溫 30min ; (3) ?。?)中樣品8.9ul到新的無菌PCR管中，加入0. lul錯配酶和lul 10*酶 buffer ;將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行酶切保溫，程序?yàn)椋?7°C保溫30min ;其中使用的錯配酶 具有識別錯配雜交雙鏈并在錯配位點(diǎn)進(jìn)行酶切使之變成兩條短雙鏈的功能，如T7核酸內(nèi) 切酶I (T7 Exonuclease I，T7EI)和芹菜Cel I酶，酶活單位不低于500單位/ml;對于錯 配酶酶活，1單位定義為在50 y 1反應(yīng)體系中37 °C下保溫1小時可將1 y g含有錯配的DNA 片段(長度為l〇〇bp)中的90%以上酶切成兩個短片段所需要的酶量。
[0009] (4)待（3)結(jié)束后，PCR管繼續(xù)留在PCR儀中，進(jìn)行變性退火操作，程序?yàn)椋合?5°C 保溫5min，再65°C保溫15min，最后25°C保溫30min ; (5) 待（4)結(jié)束后，往PCR管中加入0. lul同種錯配酶，之后將其繼續(xù)放入PCR儀中進(jìn) 行酶切保溫，程序?yàn)椋?7°C保溫30min，80°C保溫lOmin ; (6) 保溫結(jié)束后，取lul (5)中酶切處理產(chǎn)物作為模板采用不帶GC夾子的引物擴(kuò)增目 標(biāo)片段，瓊脂糖電泳驗(yàn)證擴(kuò)增成功后，瓊脂糖電泳驗(yàn)證成功后，送測序公司進(jìn)行Sanger測 序分析。
[0010] 本發(fā)明的有益效果是：直接對DGGE割膠條帶的浸出液進(jìn)行處理：先利用變性退火 過程使得少量的污染片段中的大部分和大量的目標(biāo)片段形成異源雜交雙鏈，然后采用錯配 酶切除形成的異源雜交雙鏈，這樣就可以有效消除混雜的其它片段同時目標(biāo)片段含量并未 受大的損失。由于模板得到凈化則其擴(kuò)增將得到單一的PCR產(chǎn)物，就可以直接進(jìn)行測序，從 而避免了繁瑣的克隆環(huán)節(jié)，因此可以在較低的成本下快速簡便地得到目的條帶所含片段的 準(zhǔn)確序列信息。
【附圖說明】
[0011] 圖1是DGGE技術(shù)聯(lián)合克隆測序策略進(jìn)行微生物菌群結(jié)