樣，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍。
[0034]如上所述，整個(gè)微滴定培養(yǎng)板優(yōu)選地配備有一個(gè)密封鎖扣。最終還可以對(duì)微滴定培養(yǎng)板進(jìn)行包裝和寄送。
[0035]本發(fā)明也涉及一種帶有若干個(gè)深孔的微滴定培養(yǎng)板，該深孔中裝入有一種由微生物制纖維素所制成的基底，一種細(xì)胞培養(yǎng)物在該基底上進(jìn)行增殖。微滴定培養(yǎng)板優(yōu)選地處在環(huán)境溫度下和既不進(jìn)行冷卻，也不進(jìn)行加熱。但是也可以將它冷卻到室溫以下的溫度，例如冷卻到5°(:至10°(:。
[0036]根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方式，在微滴定培養(yǎng)板的各個(gè)深孔中含有一種屬于細(xì)胞培養(yǎng)物的和具有比營養(yǎng)素溶液更高粘度的物質(zhì)。這樣細(xì)胞培養(yǎng)物就可以和基底一起粘附在器皿的底部和難以翻向一側(cè)或是浮起。
[0037]此外，本發(fā)明還涉及一種用來進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的根據(jù)上述方法所制備的人體或動(dòng)物細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的應(yīng)用。
[0038]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。其中:
[0039]圖1a-1h本發(fā)明一種實(shí)施方式所述人體或動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的制備方法的不同狀態(tài)；和
[0040]圖2帶有若干個(gè)深孔的微滴定培養(yǎng)板，深孔中裝有一種根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0041]圖1a-1h示出了一種人體或動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物9的制備方法的不同狀態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)物9日后可用于進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0042]為了制備細(xì)胞培養(yǎng)物9，首先在器皿I中裝入營養(yǎng)素溶液2 (圖1a)。例如可以將在1954年的《生物化學(xué)雜志58》(B1chemical Journal 58)，第345-352頁中所描述的Schramm和Hestrin培養(yǎng)基用作營養(yǎng)液2。營養(yǎng)液在例如每升水中可以含有20g葡萄糖、5g酵母提取物、5g細(xì)菌蛋白胨、2.7g磷酸鈉、1.15g—水檸檬酸和0.5g七水硫酸鎂。二者擇一地，也可以采用其他在現(xiàn)有技術(shù)中所公開的營養(yǎng)素溶液。
[0043]作為下一步，然后將由微生物制纖維素所制成的基底3放入器皿I中(圖1b)，該基底例如可以具有片式形狀。也可以按相反的順序進(jìn)行前面兩項(xiàng)所述步驟。可以采用DE10 2008 056 413.3或WO 2010 052 019 A2所公開的方法對(duì)由微生物制纖維素所制成的基底3進(jìn)行制備?，F(xiàn)有技術(shù)對(duì)其他用于制備微生物纖維素的制備方法進(jìn)行了充分的公開。
[0044]在圖1c中，將人體或動(dòng)物細(xì)胞4的細(xì)胞懸液加入器皿I中。貼附在基底3上的細(xì)胞可以是例如干細(xì)胞或是由干細(xì)胞所獲取的細(xì)胞、例如肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞或腎細(xì)胞，或是例如皮膚等其他器官的細(xì)胞。可以借助在US 02013025983AUUS 6410320B1或US 7534607B1中所公開的方法來對(duì)細(xì)胞4進(jìn)行制備。二者擇一地，當(dāng)然也可以采用直接取自人體或動(dòng)物體的這種細(xì)胞4。
[0045]貼附在纖維素基底上的細(xì)胞4主要是事先沒有已經(jīng)進(jìn)行傳代培養(yǎng)的這些細(xì)胞。通過一次性細(xì)胞分裂和生長過程從沒有經(jīng)歷分化過程的原始細(xì)胞來產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物9。也就是說，貼附在纖維素基底3上的細(xì)胞4優(yōu)選為是傳代數(shù)等于零的細(xì)胞。
[0046]細(xì)胞4然后在營養(yǎng)素溶液2中沉降和淀積在微晶纖維素基底3的表面上。在約37°C條件下進(jìn)行細(xì)胞分裂和生長過程，在進(jìn)行該過程時(shí)，會(huì)在幾天的時(shí)間里在基底3上形成所謂的細(xì)胞集落5，如圖1d所示，基底3完全被該細(xì)胞集落覆蓋住。
[0047]細(xì)胞集落5 —達(dá)到所期望的尺寸和厚度，分裂和生長過程就會(huì)停止。然后將器皿I及其內(nèi)容物冷卻至更低的溫度。根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方式，將器皿冷卻至室溫，例如18° -25°C。經(jīng)證明，細(xì)胞培養(yǎng)物9在該溫度下、能在幾星期的時(shí)間里，例如3星期、4星期或更上時(shí)間都保持性能穩(wěn)定和特別是細(xì)胞不會(huì)凋亡。現(xiàn)在可以視細(xì)胞的種類，在細(xì)胞上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，例如針對(duì)肉皮細(xì)胞的血管瘤添加物質(zhì)，可能的毒性物質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞的效應(yīng)和作用，或者對(duì)心肌細(xì)胞的心率的影響。
[0048]最佳地，可以在另外一個(gè)步驟Ie中添加一種可提高營養(yǎng)素溶液2的粘度的物質(zhì)10，例如亞甲基纖維素或聚乙二醇(PEG)。在圖1f中用參考標(biāo)記11對(duì)添加物質(zhì)10后所產(chǎn)生的培養(yǎng)基進(jìn)行標(biāo)識(shí)。
[0049]代替物質(zhì)10或者額外地，也可以加入一種具有比營養(yǎng)素溶液更高粘度的物質(zhì)或是在細(xì)胞培養(yǎng)物9上放置一個(gè)固體。例如可以在細(xì)胞培養(yǎng)物9上放置一個(gè)微晶纖維素體。這樣可以避免基底3和細(xì)胞培養(yǎng)物9 一起從器皿I的底部脫附和例如翻向一側(cè)或是浮起。
[0050]在另外一個(gè)步驟If中，還可以用一個(gè)密封鎖扣6對(duì)器皿I進(jìn)行密封，以防止培養(yǎng)基逸出或侵入。密封鎖扣6例如可以是一個(gè)薄膜，該薄膜例如可以和器皿I焊接或粘合在一起?？蛇x地，當(dāng)然也可以預(yù)先規(guī)定一個(gè)帶密封圈的頂蓋(未示出)。
[0051]為了對(duì)包括器皿I在內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物9進(jìn)行寄送，還會(huì)最后在步驟Ig中對(duì)器皿I進(jìn)行包裝。在顯示的實(shí)施例中，將器皿I裝入一個(gè)盒子12中和額外地通過一種填充料13來避免受到機(jī)械撞擊和損傷。
[0052]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，在也對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)的同一個(gè)器皿I中對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物9進(jìn)行寄送。
[0053]從單個(gè)方法步驟Ia至Ig中可以看出，沒有必要對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物9的細(xì)胞進(jìn)行傳代，也就是說，優(yōu)先地，細(xì)胞集落5不從基底3上脫離，和細(xì)胞并沒有進(jìn)行分離和然后重新貼附在另一個(gè)基底上進(jìn)行重新的細(xì)胞分裂。細(xì)胞培養(yǎng)物9更優(yōu)選為通過唯一一次的細(xì)胞分裂和生長過程進(jìn)行制備。
[0054]在圖1h中還顯示了，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物9還在基底3上時(shí)，該如何將被檢測(cè)的物質(zhì)14貼附在細(xì)胞培養(yǎng)物9上。然后會(huì)對(duì)細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的反應(yīng)進(jìn)行診斷。
[0055]圖2示出了帶有若干個(gè)深孔7的微滴定培養(yǎng)板8，根據(jù)圖1a至lg，該微滴定培養(yǎng)板可用作器皿I。在每個(gè)深孔7中裝入有一種由微生物制纖維素所制成的基底3，一種細(xì)胞培養(yǎng)物9在該基底上進(jìn)行增殖。可以根據(jù)圖1a至Id所示的方法步驟同時(shí)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物9進(jìn)行制備。
[0056]在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物9達(dá)到所期望的尺寸大小后，將將微滴定培養(yǎng)板8冷卻至室溫和例如如圖1f所示，利用一個(gè)薄膜6進(jìn)行封閉。然后會(huì)在每個(gè)深孔7中分布有一部分同一種細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0057]如果應(yīng)對(duì)微滴定培養(yǎng)板8進(jìn)行寄送，如圖1g所示，會(huì)在另外一個(gè)步驟中對(duì)它進(jìn)行包裝。客戶因此會(huì)收到一個(gè)裝有制備好的在數(shù)周里性能穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)物9的微滴定培養(yǎng)板，他可以在該微滴定培養(yǎng)板進(jìn)行所期望的醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.對(duì)用來進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的人體或動(dòng)物細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物(9)進(jìn)行制備的方法，包括以下步驟: -將微生物制纖維素所制成的基底(3)插入器皿(I)中； _將營養(yǎng)素溶液(2)加入器皿(I)內(nèi)； -將人體或動(dòng)物細(xì)胞(4)貼附在基底(3)上； -將器皿內(nèi)容物溫度調(diào)節(jié)至所規(guī)定的溫度，特別是調(diào)節(jié)至體溫；和 -等待，直到基底(3)完全被細(xì)胞集落(5)覆蓋住，細(xì)胞不再進(jìn)行分裂和具有靜止的不分裂的表型為止。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:將制備后的細(xì)胞培養(yǎng)物(9)冷卻至室溫。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:在進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)之前沒有對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物(9)進(jìn)行冷凍。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:貼附在基底(3)上的細(xì)胞(4)是干細(xì)胞或是由干細(xì)胞所獲取的細(xì)胞。5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:沒有事先對(duì)貼附在基底(3)上的細(xì)胞(4)進(jìn)行傳代培養(yǎng)或者具有傳代數(shù)小于等于五和特別是具有傳代數(shù)小于等于--O6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:在對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物(9)進(jìn)行制備之后和進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)之前，器皿(I)配備有一個(gè)密封鎖扣。7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:不對(duì)細(xì)胞(4)進(jìn)行傳代，也就是說，細(xì)胞集落(5)不從基底(3)上脫離，和細(xì)胞(4)并沒有進(jìn)行分離和然后重新貼附在基底(3)上進(jìn)行重新的細(xì)胞分裂。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:在對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)的同一個(gè)器皿(I)中對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物(9)進(jìn)行包裝。9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:同時(shí)可在若干個(gè)器皿(1、7)上進(jìn)行該方法。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:器皿是微滴定培養(yǎng)板(8)的深孔(7)。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:額外在器皿(1、7)中加入一種能提高營養(yǎng)素溶液(2)粘度的物質(zhì)(10)或是一種具有比營養(yǎng)素溶液(2)更高粘度的物質(zhì)。12.帶有若干個(gè)深孔(7)的微滴定培養(yǎng)板(8)，該深孔中裝入有一種由微生物制纖維素所制成的基底(3)，一種細(xì)胞培養(yǎng)物(9)在該基底上進(jìn)行增殖，其特征在于:細(xì)胞培養(yǎng)物(9)包括事先沒有進(jìn)行傳代培養(yǎng)的細(xì)胞和各個(gè)深孔(7)是密封的。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的微滴定培養(yǎng)板(8)，其特征在于:它額外含有一種能提高營養(yǎng)素溶液(2)粘度的物質(zhì)(10)或者一種屬于細(xì)胞培養(yǎng)物(9)的和具有比營養(yǎng)素溶液(2)更高粘度的物質(zhì)。14.用來進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的根據(jù)上述一種方法所制備的人體或動(dòng)物細(xì)胞(4)，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物(9)的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種對(duì)用來進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的人體或動(dòng)物細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物(9)進(jìn)行制備的方法。根據(jù)本發(fā)明，該方法至少包括以下步驟：將微生物制纖維素所制成的基底(3)插入器皿(1)中；將營養(yǎng)素溶液(2)加入器皿(1)中；將人體或動(dòng)物細(xì)胞(4)貼附在基底(3)上；將器皿內(nèi)容物溫度調(diào)節(jié)至體溫；并且等待，直到基底(3)完全被細(xì)胞集落(5)覆蓋住，也就是說，實(shí)現(xiàn)融合為止。然后可以在用這種方法制備的細(xì)胞培養(yǎng)物(9)上進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。
【IPC分類】C12N5/00
【公開號(hào)】CN105051182
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480017563
【發(fā)明人】G·貝特霍爾德特
【申請(qǐng)人】賽爾盧泰奇股份有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2014年3月25日
【公告號(hào)】DE102013005198A1, WO2014154679A1