源于桔青霉的penicitrinine A及其制備抗人肝癌藥物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種源于桔青霉的penicitrinine A及其制備抗 人肝癌藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物堿是一類(lèi)由生物次級(jí)代謝產(chǎn)生的含氮有機(jī)化合物，自然界中的生物堿種類(lèi)較 多，大多來(lái)源于植物，因此又有植物堿之稱。生物堿對(duì)人和動(dòng)物有重要的生理作用，包括平 喘鎮(zhèn)咳、降血糖、降血脂、抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等，其中以抗菌、抗腫瘤活性最為突出。天然結(jié) 構(gòu)生物堿是創(chuàng)新藥物研究中發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源，目前應(yīng)用于臨床的生物堿藥物已 經(jīng)近百種。研究發(fā)現(xiàn)，一些海洋真菌能夠在次級(jí)代謝過(guò)程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性好的生物 堿，具有很好的藥用和產(chǎn)業(yè)化前景。
[0003] 本發(fā)明人研究得知，桔青霉IBPT-5，（已于2013年12 月25日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)是：CCTCC NO :M 2013713)的發(fā)酵產(chǎn)物的粗提取物有很好的細(xì)胞增殖抑制活性，遂對(duì)其活性成分進(jìn)行研究。 研究發(fā)現(xiàn)所示生物堿類(lèi)化合物具有抗人肝癌活性，目前尚未見(jiàn)該化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞PLC/ PRF/5、HUH-7、SK-HEP-I的增殖抑制活性的報(bào)道，因此市場(chǎng)上也尚未見(jiàn)有與此相關(guān)的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種源于桔青霉的penicitrinine A及其制備抗人肝癌藥 物的應(yīng)用。該化合物具有抑制人肝癌細(xì)胞增殖作用，具有抗人肝癌活性。其結(jié)構(gòu)式為：
[0005] 該化合物的制備方法，是通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)桔青霉ciiriiwa?) IBPT-5， 獲取發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出該化合物。具體步驟如下： 1發(fā)酵生產(chǎn) 培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取桔青霉ciiri/wa?) IBPT-5接種到PDA固體 斜面培養(yǎng)基上在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，然后接種到培養(yǎng)液中，28°C靜止培養(yǎng)30天后，獲得 菌絲體和發(fā)酵液；所述培養(yǎng)液組成：每升水含甘露醇20.0 g、酵母膏3.0 g、麥芽糖20.0 g、 味精 10.0 g、葡萄糖 10.0 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4 0.3 g、NaCl 30.0 g; 2浸膏的獲得 用紗布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將發(fā)酵液用乙酸乙酯1:2 (v/v)萃取兩次，萃取液減 壓蒸餾至干，得到發(fā)酵液的乙酸乙酯浸膏32.0 g。
[0006] 3化合物的分離精制 該浸膏通過(guò)100-200目硅膠拌樣后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為洗脫液用減壓硅膠色 譜柱梯度洗脫，得到11個(gè)組分。組分7 (4.2 g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:l的洗脫物）以 二氯甲烷：甲醇為洗脫液，進(jìn)一步通過(guò)加壓硅膠柱層析梯度洗脫，得到的亞組分7-6 (二氯 甲烷：甲醇￥八=50:1的洗脫物）通過(guò)半制備液相色譜（1010型003-厶，10\250臟，5以111) : 分離流速為5 mL/min，流動(dòng)相為75%乙腈含0. 1% TFA，得到所示化合物（97. 9 mg，tR 19. 3 min) 〇
[0007] 所述桔青霉（Penicillium citrinum) ΙΒΡΤ-5,已于2013年12月25日保藏在中 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)是：CCTCC NO :Μ 2013713。
[0008] 所述的化合物在制備抑制人肝癌細(xì)胞增殖藥物中的用途，及該化合物在制備抗人 肝癌藥物中的用途。所述腫瘤細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5、HUH-7、SK-HEP-I。
[0009] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)：研究所示該生物堿化合物較為罕見(jiàn)，所述生物堿類(lèi)化合物具 有顯著的抑制人肝癌細(xì)胞增殖活性，目前尚未見(jiàn)該化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5、HUH-7、 SK-HEP-I增殖抑制活性的報(bào)道，因此市場(chǎng)上也尚未見(jiàn)有與此相關(guān)的藥物。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖 I Penicitrinine A 主要的 COSY，HMBC 和 NOESY 信號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 在如下的實(shí)施例中所指的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0012] 實(shí)施例1該化合物的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制 1發(fā)酵生產(chǎn) 生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)：按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取桔青霉（ci IBPT-5 (已于2013年12月25日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：武漢武漢大學(xué)， 保藏編號(hào)是：CCTCC NO :M 2013713)接種到PDA固體斜面培養(yǎng)基上在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 天。
[0013] 取斜面培養(yǎng)4天的桔青霉（ciiri/wa?) IBPT-5接種到裝有400mL培 養(yǎng)液[培養(yǎng)液組成（克/升）：甘露醇20. 0,酵母膏3. 0,麥芽糖20. 0,味精10. 0,葡萄糖 10. 0, KH2PO4 0· 5, MgSO4 0· 3, NaCl 30. 0 定容]的 1000 mL 錐形瓶中，28°C靜止培養(yǎng) 30 天 后，獲得菌絲體和發(fā)酵液。
[0014] 2浸膏的獲得 用紗布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將發(fā)酵液用乙酸乙酯1:2 (v/v)萃取兩次，萃取液減 壓蒸餾至干，得到發(fā)酵液的乙酸乙酯浸膏32.0 g。
[0015] 3化合物的分離精制 該浸膏通過(guò)200目硅膠拌樣后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為洗脫液用減壓硅膠色譜柱 梯度洗脫，得到11個(gè)組分。組分7 (4.2 g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:l的洗脫物）以二 氯甲烷：甲醇為洗脫液，進(jìn)一步通過(guò)加壓硅膠柱層析梯度洗脫，得到的亞組分7-6 (二氯甲 烷：甲醇v/v=50:1的洗脫物）通過(guò)半制備液相色譜（1010型0DS-A，10X250 mm，5 μπι): 分離流速為5 mL/min，流動(dòng)相為75%乙腈含0. 1% TFA，得到所示化合物（97. 9 mg，tR 19. 3 min) 〇
[0016] 化合物黃色油狀，高分辨質(zhì)譜HRESI-MS在餘々484. 2711處給出分子離子峰[Μ -ΗΓ，（calcd. for C28H38NO6, 484. 2705)，提示分子量為485,結(jié)合波譜信息推測(cè)分子式 為C2SH39N0 6。1H和13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，主要的COSY，HMBC和NOESY信號(hào)見(jiàn)圖1。
[0017] 表1 NMR 化合物的1H 和13C-NMR 數(shù)據(jù)（500MHz 1H and 125MHz 13C，in CDCl3)
實(shí)施例2體外抗腫瘤活性的測(cè)試 1實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)方法 被測(cè)樣品溶液的配制測(cè)試樣品為上述實(shí)施1中分離精制的化合物純品。精密稱取適 量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供測(cè)活性。
[0018] 細(xì)胞系及細(xì)胞的繼代培養(yǎng)采用腫瘤細(xì)胞系，腫瘤細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng) 基，在37°C于通入5% 0)2的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
[0019] 細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試方法 WST-I法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至每毫升5 X IO4個(gè)細(xì)胞，按每孔100 μ L接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37°C通入5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。吸去上清液，加 入含樣品的培養(yǎng)基100 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μ L WST-I液，培養(yǎng)4 h。利用 Bio-Rad公司產(chǎn)680型酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在450nm處的吸光值（OD)值。在同一塊96孔板中 樣品的每個(gè)濃度均設(shè)置五孔，另設(shè)五孔空白對(duì)照和無(wú)細(xì)胞調(diào)零孔（如果藥物有顏色要做相 應(yīng)藥物濃度無(wú)細(xì)胞調(diào)零）。各孔OD值先做相應(yīng)無(wú)細(xì)胞調(diào)零，再取五孔平均OD值按IR (%) =(0D空自對(duì)照_0D樣帛）/OD空自對(duì)照X 100%式計(jì)算母?jìng)€(gè)濃度下細(xì)胞增殖抑制率（IR%)。
[0020] 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試結(jié)果 在WST-I法測(cè)試中，根據(jù)不同濃度的該化合物的腫瘤細(xì)胞增殖抑制率，應(yīng)用SPSS16. 0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC5。值。結(jié)果見(jiàn)表2。
[0021] 表2化合物對(duì)人人肝癌細(xì)胞增殖的抑制活性
3.結(jié)論 該化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5、HUH-7、SK-HEP-I具有較好的抗腫瘤活性。可作為 制備人肝癌細(xì)胞增殖抑制藥物或抗腫瘤藥物用于人肝癌的研究。
[0022] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 源于桔青霉的penicitrinine A，其特征在于：所述化合物結(jié)構(gòu)式為2. 如權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于：發(fā)酵培養(yǎng)桔青霉（ ciiri/w?) IBPT-5,獲取發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出該化合物，所述桔青霉 IBPT-5,已于2013年12月25日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，地址：武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)是：CCTCC NO :M 2013713。3. 如權(quán)利要求1所述的化合物在制備抑制人肝癌細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的腫瘤細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞PLC/ PRF/5、HUH-7、SK-HEP-I。5. 如權(quán)利要求1所述的化合物在制備抗人肝癌藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種源于桔青霉的penicitrinine？A及其制備抗人肝癌藥物的應(yīng)用。該化合物具有抑制人肝癌細(xì)胞增殖作用。其結(jié)構(gòu)式為：。通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)桔青霉？(<i>Penicillium</i><i>？citrinum</i>)？IBPT-5，獲取發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出該化合物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5、HUH-7、SK-HEP-1具有較好的抗腫瘤活性。可作為制備人肝癌細(xì)胞增殖抑制藥物或抗腫瘤藥物用于人肝癌的研究。CCTCC NO：M 201371320131225
【IPC分類(lèi)】A61K31/407, C12R1/80, C07D491/20, A61P35/00, C12P17/18
【公開(kāi)號(hào)】CN105061443
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510422116
【發(fā)明人】劉沁穎, 陳立, 鄭秋紅, 應(yīng)敏剛, 周彤
【申請(qǐng)人】福建省腫瘤醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年7月17日