一種磷光銥配合物的合成及其用于血吸蟲(chóng)尾蚴熒光標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于寄生蟲(chóng)病防治的生物光學(xué)標(biāo)記領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一類磷光 銥配合物的合成及其用于血吸蟲(chóng)尾蝴熒光標(biāo)記，本發(fā)明提供了一種新穎的血吸蟲(chóng)尾蝴熒光 標(biāo)記方法，該類磷光銥配合物具有血吸蟲(chóng)尾蝴熒光標(biāo)記的有益效果。
【背景技術(shù)】
[0002] 全球人類寄生蟲(chóng)病中，血吸蟲(chóng)病是僅次于瘧疾的第二大熱帶寄生蟲(chóng)病。血吸蟲(chóng)病 流行于74個(gè)國(guó)家和地區(qū)，估計(jì)目前有6. 52億人口受威脅，有1. 93億感染者，有癥狀病例約 1. 2億，其中2000萬(wàn)為嚴(yán)重病例。我國(guó)是血吸蟲(chóng)病的主要流行區(qū)，血吸蟲(chóng)病是一種典型的經(jīng) 水源傳播的人獸共患寄生蟲(chóng)病，血吸蟲(chóng)尾蝴對(duì)宿主感染力非常強(qiáng)，成蟲(chóng)繁殖速度快，數(shù)量驚 人。近年來(lái)頻繁發(fā)生的洪澇災(zāi)害，更加快了血吸蟲(chóng)病的擴(kuò)散、蔓延。血吸蟲(chóng)尾蝴是感染人畜 的唯一階段，所以控制尾蝴是治理血吸蟲(chóng)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，部分抗血吸蟲(chóng)藥物對(duì)血吸蟲(chóng) 尾蝴有良好的殺滅效果，但其確切的作用機(jī)理尚不完全清楚。研究者通過(guò)使用傳統(tǒng)的研究 方法來(lái)探索這些藥物的可能作用機(jī)理，但是，這些傳統(tǒng)研究手段都是一個(gè)離體(死亡）的檢 測(cè)，不能直接反映藥物在活體上的作用方式和位點(diǎn)，中間環(huán)節(jié)會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信 度。所以，需要尋找新的研究方法來(lái)彌補(bǔ)目前存在的不足。
[0003] 熒光成像是一項(xiàng)靈敏的、非侵入式、費(fèi)用低廉的可視化檢測(cè)途徑，其分辨率可達(dá)百 納米，可實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞到動(dòng)物的活體成像，熒光成像手段具有監(jiān)測(cè)靈敏、成像迅速、可同時(shí)觀 測(cè)多分子事件等優(yōu)點(diǎn)?；谟袡C(jī)熒光染料的熒光成像廣泛用于寄生蟲(chóng)方面的研究，如曼氏 血吸蟲(chóng)研究中Andrea B. Kohn等人米用4, 5-diaminoXuorescein_2焚光探針檢測(cè)血吸蟲(chóng) 體內(nèi)一氧化氮的含量。但是，使用有機(jī)小分子熒光染料作為熒光探針，存在以下的缺點(diǎn)： (1)有機(jī)熒光染料激發(fā)與發(fā)射位于紫外或者可見(jiàn)光區(qū)域，在熒光成像時(shí)容易產(chǎn)生組織光損 傷和生物組織自發(fā)熒光問(wèn)題，干擾熒光成像的質(zhì)量；（2)有機(jī)熒光染料的抗光漂白性較差， 受強(qiáng)激發(fā)光照射與照射時(shí)間增加時(shí)，容易產(chǎn)生光漂白現(xiàn)象，其熒光強(qiáng)度顯著下降，導(dǎo)致熒光 成像時(shí)信號(hào)太弱無(wú)法檢出。
[0004] 相比于其它發(fā)光材料而言，磷光金屬配合物與傳統(tǒng)的幾類熒光染料相比具有優(yōu)異 的磷光物理性質(zhì)，如具有Stokes位移大、發(fā)光效率高、光穩(wěn)定性好、發(fā)光顏色可調(diào)、發(fā)光壽 命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。磷光配合物具有較長(zhǎng)的發(fā)光壽命，通過(guò)時(shí)間分辨技術(shù)可以減少或消除樣品自 發(fā)熒光的影響。
[0005] 但是，目前磷光銥配合物用于血吸蟲(chóng)尾蝴的熒光標(biāo)記尚無(wú)系統(tǒng)的研究，如何實(shí)現(xiàn) 磷光配合物對(duì)尾蝴的熒光標(biāo)記是難點(diǎn)，其主要原因是血吸蟲(chóng)尾蝴是完整的生物體，具有完 整的生命新陳代謝系統(tǒng)。比如，尾蝴表皮上的糖萼具有抗原性質(zhì)，也具有使尾蝴機(jī)體得到保 護(hù)免受外界影響的作用。如何實(shí)現(xiàn)熒光染料對(duì)尾蝴的有效熒光標(biāo)記，需要系統(tǒng)研究尾蝴熒 光標(biāo)記與磷光配合物結(jié)構(gòu)方面的構(gòu)效關(guān)系，同時(shí)磷光配合物需要滿足發(fā)光效率高、光穩(wěn)定 性好和生物相容性好的特性，這樣的標(biāo)記方法不同于傳統(tǒng)的細(xì)胞熒光標(biāo)記，尾蝴的磷光配 合物標(biāo)記具有更多的影響因素和技術(shù)上的困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一類磷光銥配合物，該類配合物的磷光發(fā)射可以通過(guò)改變環(huán)金屬配 體的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)發(fā)射波長(zhǎng)從可見(jiàn)光到近紅外光的調(diào)節(jié)，并具有較高的發(fā)光量子效率和較長(zhǎng)的 發(fā)射壽命，具有對(duì)日本血吸蟲(chóng)尾蝴進(jìn)行磷光標(biāo)記的性能，可作為日本血吸蟲(chóng)尾蝴磷光標(biāo)記 試劑。
[0007] 本發(fā)明的銥配合物的結(jié)構(gòu)是通過(guò)兩個(gè)含氮芳香化合物為雙齒配體、輔以一個(gè)含雙 氮芳香化合物，配位形成銥配合物。該類銥配合物具有下式結(jié)構(gòu)：
式中含氮的芳香化合物的雙齒配體和輔助雙齒配體，其去質(zhì)子后能與銥原子配位形成 六元配位的發(fā)光銥配合物。
[0008] 其中丨
基團(tuán)為含氮芳香基團(tuán)及其衍生物，優(yōu)選為下述基團(tuán)之一：
2.通式中輔助配體
中X可以為氮，優(yōu)選為下述配體之一：
3.通式中抗衡陰離子Y為下述離子：PF6、Cl。
[0009] 本發(fā)明化合物可按照如下合成路線制備：

合成路線中第一步可按本領(lǐng)域已知的方法制備(參見(jiàn)Nonoyama, K.及/以.CAeva //w. 1974，47，467-468.)。制備本發(fā)明化合物的原料和所用試劑均為已知化合物，可以 在市場(chǎng)上獲得，或可用本領(lǐng)域已知的方法制備。
[0010] 將三氯化銥水合物與含氮的雙齒配體：在2-乙氧基乙醇和水的混合溶液中加 熱反應(yīng)24-48小時(shí)，得到銥二氯橋配合物；然后，得到的產(chǎn)物在有機(jī)溶劑、水或者混合溶劑 中與相應(yīng)的輔助配體
反應(yīng)4-24小時(shí)，合成到所需的目標(biāo)產(chǎn)物。
[0011] 上述任意一種磷光銥配合物作為血吸蟲(chóng)尾蝴熒光標(biāo)記染料。
[0012] 尾蝴熒光標(biāo)記方法包括如下步驟： 新鮮的尾蝴從感染毛蝴的陽(yáng)性的釘螺得到，取陽(yáng)性螺于100 mL錐形瓶中，加入清水至 瓶口，在白熾燈下光照2小時(shí)左右逸出尾蝴； 磷光配合物用二甲基亞砜溶解準(zhǔn)確配制成I mmol的母液，然后再用PBS緩沖液稀釋 成5 μΜ的稀釋液；移取200 yL的稀釋液加入到熒光成像器皿中，用自制的鐵絲圈取新 鮮尾蝴加入到稀釋液中，在室溫下熒光染色5分鐘至6小時(shí)，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察尾 蝴的磷光標(biāo)記情況，并采集磷光信號(hào)進(jìn)行熒光成像。
[0013] 發(fā)明人通過(guò)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與合成，將發(fā)光銥配合物作為熒光探針用于血吸蟲(chóng)尾蝴熒 光標(biāo)記的研究，可以成功地解決尾蝴熒光成像過(guò)程中自發(fā)熒光干擾與光漂白的問(wèn)題。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1配合物Ir-I的吸收光譜和磷光發(fā)射光譜。
[0015] 圖2配合物Ir-2的吸收光譜和磷光發(fā)射光譜。
[0016] 圖3配合物Ir-3的吸收光譜和磷光發(fā)射光譜。
[0017] 圖4配合物Ir-4的吸收光譜和磷光發(fā)射光譜。
[0018] 圖5配合物Ir-5的吸收光譜和磷光發(fā)射光譜。
[0019] 圖6.配合物Ir-I標(biāo)記日本血吸蟲(chóng)尾蝴的激光共聚焦熒光成像圖。
[0020] 圖7.配合物Ir-4標(biāo)記日本血吸蟲(chóng)尾蝴的激光共聚焦熒光成像圖。
[0021] 圖8.配合物Ir-5標(biāo)記日本血吸蟲(chóng)尾蝴的激光共聚焦熒光成像圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0023] 下文給出了本發(fā)明化合物的具體實(shí)施例，但對(duì)本發(fā)明不構(gòu)成任何限制。本實(shí)施例 中所用的原料均為已知化合物，可以由商業(yè)途徑獲得，或可按相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)方法合成。
[0024] 在下述實(shí)施例中，所涉及的理化參數(shù)由下述儀器測(cè)定的=1H NMR譜在Bruker Mercuryplus 核磁儀上米用 400 MHz 測(cè)定；質(zhì)譜數(shù)據(jù)在 Applied Biosystems VOYGER DE-STR型質(zhì)譜儀上測(cè)得；紫外可見(jiàn)吸收光譜在Shimadzu UV-2700型紫外-可見(jiàn)吸收光譜 儀上完成；磷光發(fā)射光譜由PerkinElmer LS-55熒光光譜儀測(cè)定；尾蝴磷光成像在OLYMPUS FV1000型激光共聚焦熒光顯微鏡上進(jìn)行，激光器提供波長(zhǎng)為405 nm和515nm的激發(fā)光源， 根據(jù)不同銥配合物的磷光性質(zhì)收集500 nm-700 nm范圍內(nèi)的發(fā)射信號(hào)進(jìn)行熒光成像。
[0025] 實(shí)施例1
(1) ΗΟ-bt的合成：將I mmol的4-苯酸硼酸，I mmol的2-氯苯并噻唑，7%當(dāng)量的四 (3-苯基膦）鈀（0)和I mmol的碳酸鉀加入到三頸燒瓶中，然后加入30 mL THF和氏0(乂/ V=I :1)的混合溶劑。在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，反應(yīng)體系在70 °C反應(yīng)24 h。冷卻至室溫，反應(yīng)液 用二氯甲烷萃取，水相用二氯甲烷萃取3次（10 mL X 3)，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥， 減壓除去溶劑后柱層析分離得到產(chǎn)物。
[0026] (2)三縮二乙二醇單端酯的合成：將Immol三縮二乙二醇加入三頸燒瓶中，加入1 mmol的吡啶，用20 ml的二氯甲烷溶解。在0 °C冰浴中攪拌。用二氯甲烷將Immol對(duì)甲基 苯磺酰氯溶解，緩慢滴入三頸燒瓶中。反應(yīng)3 h后用鹽酸洗滌，取有機(jī)層加水洗至水溶液呈 中性。無(wú)水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到產(chǎn)物。
[0027] (3)配體PEG-bt的合成：將I mmol三縮二乙二醇單端酯，I mmol碳酸鉀，10%當(dāng) 量的四丁基溴化銨加入三頸瓶中，用20 ml的乙腈溶解。在80°C油浴中攪拌回流。緩慢 滴入乙腈溶解的I mmol ΗΟ-bt。反應(yīng)10 h后，冷卻至室溫。反應(yīng)液用二氯甲燒萃取，水相 用二氯甲烷萃取3次（10 mL X3)，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到配體 PEG-bt〇
[0028] (4) PEG-bt 銥二氯橋配合物的合成(參見(jiàn)文獻(xiàn)1'1〇11〇5^1]^，1(.131111.〇16111.3〇(3· Jpn. 1974，47，467-468.)。
[0029] 0. 5 mmol的三氯化銥水合物和I mmol的配體PEG-bt溶于25 mL的2-乙氧基乙 醇和水的混合液中（v/v=3 :1)，110 °C反應(yīng)24 h，室溫冷卻。抽濾收集固體，分別用蒸餾水 和無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，即得PEG-bt銥二氯橋配合物。
[0030] (5) [Ir(PEG_bt)2(bpy)] [PF6] (Ir-I)的合成：將 0· 2 mmol 的 PEG-bt 銥二氯橋 配合物，0.4 mmol的1，10-鄰菲羅啉加入圓底燒瓶中，然后加入30 mL二氯甲烷和甲醇（v/ v=2:l)。在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，反應(yīng)體系在50 °C反應(yīng)10 h。再加入10倍當(dāng)量的KPF6，繼續(xù)反 應(yīng)4 h。室溫冷卻，抽濾收集液體，減壓除去溶劑后柱層析分離得到產(chǎn)物。核磁表征數(shù)據(jù)： 1H NMR (400 MHz, DMS0) δ 8.94 (dd, / = 8. 3, 1.3 Hz, 2H), 8.48 (dd, J= 5.1, 1.2 Hz, 2H), 8.33 (s, 2H), 8.13 (dd, / = 8. 3, 5.1 Hz, 2H), 8.08 (d, J= 7.8 Hz, 2H), 8.02 (d, /= 8.6 Hz, 2H), 7.23 (dd, J= 11.8, 4.5 Hz, 2H), 6.90 - 6.85 (m, 2H), 6.82 (dd, /=8.7, 2.4 Hz, 2H), 5.80 (d, / = 2.4 Hz, 2H), 5.66 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.53 (t, / = 5. 5 Hz, 2H), 3.53 (t, / = 4.6 Hz, 4H), 3.45 - 3.39 (m, 12H), 3. 36 - 3.30 (m, 8H).配合物Ir-I的吸收光譜和熒光光譜如圖I所示。
[0031] 實(shí)施例2
[Ir(CH0-ppy)2(phen)] [PF6] (Ir-2)的合成：
(1)配體CHO-ppy的合成：將I mmol的4-醛基苯硼酸，I mmol的2-氯P比啶，7%當(dāng)量 的四（3-苯基膦）鈀（0)和I mmol的碳酸鉀加入到三頸燒瓶中，然后加入50 mL 1'冊(cè)和氏0 (V/V=l:l)的混合溶劑。在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，反應(yīng)體系在70 °C反應(yīng)24 h。冷卻至室溫，反應(yīng) 液用二氯甲烷萃取，水相用二氯甲烷萃取3次（10 mL X3)，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥 過(guò)夜，減壓除去溶劑后柱層析分離得到CH〇-ppy。
[0032] (2)CH0_ppy 銥二氯橋配合物的合成(參見(jiàn)文獻(xiàn)1'1〇11〇5^1]^，1(.131111.〇16111.3〇(3· Jpn. 1974，47，467-468.)。
[0033] (3)將0· 25 mmol的CH〇-ppy銥二氯橋配合物，0· 5 mmol的1，10-鄰菲羅啉加入 圓底燒瓶中，然后加入30 mL的二氯甲烷和甲醇（v/v=2:l)。在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，反應(yīng)體系在 50 °C反應(yīng)10 h。再加入10倍當(dāng)量的KPF6，繼續(xù)反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，抽濾收集 液體，減壓除去溶劑后柱層析分離，所得即為產(chǎn)物。核磁表征數(shù)據(jù)：? NMR (400 MHz，DMS0) δ 9.75 (s, 2H), 8.91 (d, J= ?Λ Hz, 2H), 8.46 (d,