發(fā)明提 供的聚氨基酸具有式I所示的結(jié)構(gòu)。
[0108] 按照下述方法測試本發(fā)明提供的載藥膠束的組織蛋白酶B的響應(yīng)性，具體為：
[0109] 將本發(fā)明提供的載藥膠束在pH值為7. 4時在有組織蛋白酶B和無組織蛋白酶B 的條件下進(jìn)行藥物釋放實驗，所述藥物釋放實驗的具體的步驟為：配制磷酸氫二鈉-檸檬 酸緩沖溶液，其中pH值為7. 4,加入乙二胺四乙酸，其中乙二胺四乙酸濃度為0. 2mmol/L ;再 向磷酸氫二鈉-檸檬酸-乙二胺四乙酸緩沖溶液中加入組織蛋白酶B，其中組織蛋白酶B的 濃度為lOOunit/mL ;將本發(fā)明提供的載藥膠束分別溶于IOmL磷酸氫二鈉-檸檬酸-乙二胺 四乙酸緩沖溶液和磷酸氫二鈉-檸檬酸-乙二胺四乙酸-組織蛋白酶B緩沖溶液中，放入 3500Dalton的透析袋中，將透析袋放入相應(yīng)的緩沖溶液中，其中緩沖溶液的體積為IOOmL ; 放入37°C的搖床中，震蕩速率為70r/min。在2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h，72h分別取出2mL 緩沖溶液，再加入相應(yīng)的2mL緩沖溶液；將取出的緩沖溶液用熒光分光光度計測量阿霉素 的量以得到相應(yīng)的藥物累積釋放與時間的曲線。
[0110] 實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的載藥膠束在有組織蛋白酶B的緩沖溶液中的藥物釋 放率遠(yuǎn)比無組織蛋白酶B的大，本發(fā)明提供的載藥膠束具有組織蛋白酶B響應(yīng)性，包裹在載 藥膠束內(nèi)部的抗腫瘤藥物在腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞內(nèi)的組織蛋白酶B的條件下可以快速釋 放，從而達(dá)到增強(qiáng)藥物效果。
[0111] 本發(fā)明以下實施例所用的原料均為市售商品。
[0112] 實施例1
[0113] 將20g的數(shù)均分子量為2000的聚乙二醇單甲醚放入干燥的反應(yīng)瓶中，然后在 120°C且攪拌的條件下抽真空2h，將反應(yīng)瓶進(jìn)行油浴，當(dāng)溫度為60°C時，分別向反應(yīng)瓶中加 入IOg的無水硫酸鎂，200mL除過水的二氯甲烷，在冰水浴的條件向反應(yīng)瓶中加入5mL的三 乙胺，30mL的甲基磺酰氯，在25°C、攪拌子攪拌條件下反應(yīng)72h，反應(yīng)結(jié)束后，將得到的反應(yīng) 產(chǎn)物用飽和的氯化鈉溶液洗滌五次后加入無水硫酸鎂干燥過夜；將干燥后的產(chǎn)物用無水乙 醚沉降，在25°C下真空干燥24h后，得到中間產(chǎn)物；
[0114] 將所述中間產(chǎn)物和與所述中間產(chǎn)物等質(zhì)量的氯化銨溶于氨水中，氨水的體積為中 間產(chǎn)物質(zhì)量的10倍，在25°c攪拌條件下反應(yīng)4天，將得到的反應(yīng)產(chǎn)物用二氯甲烷萃取，將 萃取后的產(chǎn)物用飽和氯化鈉溶液洗滌三次后加入無水硫酸鎂干燥12h，抽濾，將液體旋蒸至 150mL，將旋蒸后的產(chǎn)物用無水乙醚沉降兩次，在25°C下真空干燥24h后，得到端氨基聚乙 二醇單甲醚。
[0115] 對本發(fā)明實施例1制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚進(jìn)行核磁共振檢測和紅外 檢測，檢測結(jié)果為，本發(fā)明實施例1制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚具有式1所示的結(jié) 構(gòu)：
[0116]
[0117] 式 1 中，η 為 45。
[0118] 按照下述公式計算本發(fā)明實施例1制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚的產(chǎn)率：
[0119] 產(chǎn)率=實際得到的產(chǎn)物質(zhì)量/理論得到的產(chǎn)物質(zhì)量X 100% ;
[0120] 計算結(jié)果為，本發(fā)明實施例1制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚的產(chǎn)率為 89. 8%〇
[0121] 實施例2
[0122] 將20g的數(shù)均分子量為4000的聚乙二醇單甲醚放入干燥的反應(yīng)瓶中，然后在 120°C且攪拌的條件下抽真空2h，將反應(yīng)瓶進(jìn)行油浴，當(dāng)溫度為60°C時，分別向反應(yīng)瓶中加 入IOg的無水硫酸鎂，200mL除過水的二氯甲烷，在冰水浴的條件向反應(yīng)瓶中加入2. 5mL的 三乙胺，15mL的甲基磺酰氯，在25°C、攪拌子攪拌條件下反應(yīng)72h，反應(yīng)結(jié)束后，將得到的反 應(yīng)產(chǎn)物用飽和的氯化鈉溶液洗滌五次后加入無水硫酸鎂干燥過夜；將干燥后的產(chǎn)物用無水 乙醚沉降，在25°C下真空干燥24h后，得到中間產(chǎn)物；
[0123] 將所述中間產(chǎn)物和與所述中間產(chǎn)物等質(zhì)量的氯化銨溶于氨水中，氨水的體積為中 間產(chǎn)物質(zhì)量的10倍，在25°C攪拌條件下反應(yīng)4天，將得到的反應(yīng)產(chǎn)物用二氯甲烷萃取，將 萃取后的產(chǎn)物用飽和氯化鈉溶液洗滌三次后加入無水硫酸鎂干燥12h，抽濾，將液體旋蒸至 150mL，將旋蒸后的產(chǎn)物用無水乙醚沉降兩次，在25°C下真空干燥24h后，得到端氨基聚乙 二醇單甲醚。
[0124] 對本發(fā)明實施例2制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚進(jìn)行核磁共振檢測，檢測結(jié) 果為，本發(fā)明實施例2制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚具有式2所示的結(jié)構(gòu)：
[0125]
[0126] 式 2 中，η 為 90。
[0127] 按照實施例1所述的方法計算本發(fā)明實施例2制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚 的產(chǎn)率；計算結(jié)果為，本發(fā)明實施例2制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚的產(chǎn)率為93. 6%。
[0128] 實施例3
[0129] 將20g的數(shù)均分子量為5000的聚乙二醇單甲醚放入干燥的反應(yīng)瓶中，然后在 120°C且攪拌的條件下抽真空2h，將反應(yīng)瓶進(jìn)行油浴，當(dāng)溫度為60°C時，分別向反應(yīng)瓶中加 入IOg的無水硫酸鎂，200mL除過水的二氯甲烷，在冰水浴的條件向反應(yīng)瓶中加入2mL的三 乙胺，12mL的甲基磺酰氯，在25°C、攪拌子攪拌條件下反應(yīng)72h，反應(yīng)結(jié)束后，將得到的反應(yīng) 產(chǎn)物用飽和的氯化鈉溶液洗滌五次后加入無水硫酸鎂干燥過夜；將干燥后的產(chǎn)物用無水乙 醚沉降，在25°C下真空干燥24h后，得到中間產(chǎn)物；
[0130] 將所述中間產(chǎn)物和與所述中間產(chǎn)物等質(zhì)量的氯化銨溶于氨水中，氨水的體積為中 間產(chǎn)物質(zhì)量的10倍，在25°C攪拌條件下反應(yīng)4天，將得到的反應(yīng)產(chǎn)物用二氯甲烷萃取，將 萃取后的產(chǎn)物用飽和氯化鈉溶液洗滌三次后加入無水硫酸鎂干燥12h，抽濾，將液體旋蒸至 150mL，將旋蒸后的產(chǎn)物用無水乙醚沉降兩次，在25°C下真空干燥24h后，得到端氨基聚乙 二醇單甲醚。
[0131] 對本發(fā)明實施例3制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚進(jìn)行核磁共振檢測，檢測結(jié) 果如圖1和圖2所示，圖1為本發(fā)明實施例3制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚核磁共振 譜圖，圖2為本發(fā)明實施例3制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚紅外譜圖，由圖1和圖2可 知，本發(fā)明實施例3制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚具有式3所示的結(jié)構(gòu)：
[0132]
[0133] 式 3 中，η 為 114。
[0134] 按照實施例1所述的方法計算本發(fā)明實施例3制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚 的產(chǎn)率；計算結(jié)果為，本發(fā)明實施例3制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚的產(chǎn)率為95. 9%。
[0135] 實施例4
[0136] 將20g的數(shù)均分子量為8000的聚乙二醇單甲醚放入干燥的反應(yīng)瓶中，然后在 120°C且攪拌的條件下抽真空2h，將反應(yīng)瓶進(jìn)行油浴，當(dāng)溫度為60°C時，分別向反應(yīng)瓶中加 入IOg的無水硫酸鎂，200mL除過水的二氯甲燒，在冰水浴的條件向反應(yīng)瓶中加入I. 25mL的 三乙胺，7. 5mL的甲基磺酰氯，在25°C、攪拌子攪拌條件下反應(yīng)72h，反應(yīng)結(jié)束后，將得到的 反應(yīng)產(chǎn)物用飽和的氯化鈉溶液洗滌五次后加入無水硫酸鎂干燥過夜；將干燥后的產(chǎn)物用無 水乙醚沉降，在25°C下真空干燥24h后，得到中間產(chǎn)物；
[0137] 將所述中間產(chǎn)物和與所述中間產(chǎn)物等質(zhì)量的氯化銨溶于氨水中，氨水的體積為中 間產(chǎn)物質(zhì)量的10倍，在25°c攪拌條件下反應(yīng)4天，將得到的反應(yīng)產(chǎn)物用二氯甲烷萃取，將 萃取后的產(chǎn)物用飽和氯化鈉溶液洗滌三次后加入無水硫酸鎂干燥12h，抽濾，將液體旋蒸至 150mL，將旋蒸后的產(chǎn)物用無水乙醚沉降兩次，在25°C下真空干燥24h后，得到端氨基聚乙 二醇單甲醚。
[0138] 對本發(fā)明實施例4制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚進(jìn)行核磁共振檢測，檢測結(jié) 果為，本發(fā)明實施例4制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚具有式4所示的結(jié)構(gòu)：
[0139]
[0140] 式 4 中，η 為 182。
[0141] 按照實施例1所述的方法計算本發(fā)明實施例4制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚 的產(chǎn)率；計算結(jié)果為，本發(fā)明實施例4制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚的產(chǎn)率為97. 5%。
[0142] 實施例5
[0143] 在70°C加熱攪拌的條件下，用除過水的四氫呋喃將IOg的瓜氨酸溶解于干燥的三 口瓶中，通氮?dú)?，加?g的三光氣，一個小時后再加入5g的三光氣，兩個小時后再加入4g 的三光氣，共攪拌回流3個小時；將得到的反應(yīng)產(chǎn)物用氮?dú)獯蛋雮€小時后，依次用冷的正己 烷沉降，冷的乙酸乙酯溶解，冷的碳酸氫鈉溶液洗滌一次，再用冷水洗滌三次，將洗滌后的 產(chǎn)物和無水硫酸鎂混合后放入-20°C冰箱中干燥過夜；將干燥后的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，將溶液 中的溶劑抽干后，得到瓜氨酸-N-內(nèi)羧酸酐。
[0144] 對本發(fā)明實施例5制備得到的瓜氨酸-N-內(nèi)羧酸酐進(jìn)行核磁共振檢測，檢測結(jié)果 如圖3所示，圖3為本發(fā)明實施例5制備得到的瓜氨酸-N-內(nèi)羧酸酐的核磁共振氫譜圖，由 圖3可知，本發(fā)明實施例5制備的瓜氨酸-N-內(nèi)羧酸酐具有式III所示的結(jié)構(gòu)：
[0145]
[0146] 實施例6
[0147] 在50°C加熱攪拌條件下，用除過水的四氫呋喃將20g的纈氨酸溶解于干燥的三口 瓶中，通氮?dú)?，加?2g的三光氣，一個小時后再加入5g的三光氣，兩個小時后再加入2g的 三光氣2g，攪拌至澄清；將得到的反應(yīng)產(chǎn)物用氮?dú)獯蛋雮€小時后，依次用冷的正己烷沉降， 冷的乙酸乙酯溶解，冷的碳酸氫鈉溶液洗滌一次，再用冷水洗滌三次，將洗滌后的產(chǎn)物和無 水硫酸鎂混合后放入冰箱中干燥過夜；將干燥后的產(chǎn)物抽濾，將溶液中的溶劑抽干后重結(jié) 晶、干燥，得到纈氨酸-N-內(nèi)羧酸酐。
[0148] 對本發(fā)明實施例6制備得到的纈氨酸-N-內(nèi)羧酸酐進(jìn)行核磁共振檢測，檢測結(jié)果 如圖4所示，圖4為本發(fā)明實施例6制備得到的纈氨酸-N-內(nèi)羧酸酐核磁共振氫譜圖，由圖 4可知，本發(fā)明實施例6制備的纈氨酸-N-內(nèi)羧酸酐具有式IV所示的結(jié)構(gòu)：
[0149]
[0150] 實施例7
[0151] 將2g實施例1制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚用IOOmL甲苯溶解，在抽真空 和120°C加熱的條件下進(jìn)行共沸除水，共沸除水2h后，加入除過水的200mL的二甲基甲酰 胺進(jìn)行溶解，向得到的溶液中加入I. 〇〇61g的實施例5制備得到的瓜氨酸-N-內(nèi)羧酸酐和 I. 452g的實施例6制備得到的纈氨酸-N-內(nèi)羧酸酐，在抽真空0. 5h后4°C下反應(yīng)72h ;將 得到的反應(yīng)產(chǎn)物用無水乙醚沉降三次，干燥后得到聚氨基酸。
[0152] 對本發(fā)明實施例7制備得到的聚氨基酸進(jìn)行核磁共振檢測和紅外檢測，檢測結(jié)果 為，本發(fā)明實施例7制備得到的聚氨基酸具有式5所示的結(jié)構(gòu)：
[0153]
[0154] 式 5 中，η 為 45, i 為 5, j 為 10。
[0155] 通過凝膠滲透色譜的方法測試本發(fā)明實施例7制備得到的聚氨基酸的數(shù)均分子 量，檢測結(jié)果為，本發(fā)明實施例7制備得到的聚氨基酸的數(shù)均分子量為3890g/m 〇L。
[0156] 按照實施例1所述的方法計算本發(fā)明實施例7制備得到聚氨基酸的產(chǎn)率，計算結(jié) 果為，本發(fā)明實施例7制備得到的聚氨基酸的產(chǎn)率為90. 5%。
[0157] 實施例8
[0158] 按照實施例7所述的方法制備聚氨基酸，與實施例7不同的是，采用4g實施例2 制備得到的端氨基聚乙二醇單甲醚替換實施例7中2g實施例1制備得到的端氨基聚乙二 醇單甲醚。
[0159] 對本發(fā)明實施例8制備得到的聚氨基酸進(jìn)行核磁共振檢測和紅外檢測，檢測結(jié)果 為，本發(fā)明實施例8制備得到的聚氨基酸具有式6所示的結(jié)構(gòu)：
[0160]
[0161] 式 6 中，η 為 90, i 為 5, j 為 10。
[0162] 按照實施例7所述的方法，測試本發(fā)明實施例8制備得到的聚氨基酸的數(shù)均分子 量，檢測結(jié)果為，本發(fā)明實施例8制備得到的聚氨基酸的數(shù)均分子量為5880g/m 〇L。
[0163] 按照實施例1所述的方法計算本發(fā)明實施例8制備得到聚氨基酸的產(chǎn)率，計算結(jié) 果為，本發(fā)明實施例8制備得到的聚氨基酸的產(chǎn)率為92