一種優(yōu)化有機磷水解酶酵母工程菌及其酶的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001] 本發(fā)明涉及一種有機磷水解酶的重組酵母表達菌株的構(gòu)建方法及該工程菌高密 度的發(fā)酵方法,屬于基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】:
[0002] 有機磷農(nóng)藥因具有高效、低成本、殺蟲廣泛等特點,對農(nóng)業(yè)發(fā)展和人類糧食供給做 出了巨大的貢獻。目前我國生產(chǎn)的農(nóng)藥中,有機磷農(nóng)藥占到了農(nóng)藥總量的70%以上,有機磷 農(nóng)藥的大量不合理使用也使得蔬菜、糧食、瓜果等農(nóng)產(chǎn)品以及土壤、水體中的有機磷農(nóng)藥殘 留嚴(yán)重超標(biāo)。但由于有機磷農(nóng)藥具有較強的毒性,能抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的 活性,進而導(dǎo)致體內(nèi)乙酰膽堿的大量聚集而中毒,和不易被降解等特點,農(nóng)村大量使用有機 磷農(nóng)藥的同時又帶來了日益嚴(yán)重的環(huán)境污染與人畜健康問題,甚至對農(nóng)產(chǎn)品出口創(chuàng)匯也造 成了嚴(yán)重影響。
[0003] 有機磷水解酶又稱磷酸三酯酶,廣泛存在于自然界中的生物體內(nèi),它可以降解包 括有機磷神經(jīng)毒化學(xué)戰(zhàn)劑和一些廣泛使用的農(nóng)用殺蟲劑在內(nèi)的一大類有機磷化合物,其作 用原理通常為:將有機磷農(nóng)藥分子中的磷酯鍵斷裂,使有機磷農(nóng)藥分解為環(huán)境可以接受的 低毒或無毒小分子物質(zhì),從而達到降低毒性的目的。自1973年Sethunarhan等從土壤中分 離出乙基對硫磷降解Flavobacterium sp. ATCC 27551以來,農(nóng)藥降解菌研究的序幕被正式 拉開,農(nóng)藥降解菌的篩選及相關(guān)基因的研究也成為了國內(nèi)外科學(xué)家的主要研究方向。目前 為止,人們已經(jīng)篩選出的有機磷農(nóng)藥降解菌近百種,其中包括細菌、真菌、放線菌以及藻類 等。然而,隨著環(huán)境中有機磷農(nóng)藥釋放量的日益增加,天然存在于自然界的這些有機磷農(nóng)藥 降解菌顯然已經(jīng)不能滿足人類的降毒要求。所以研究者們利用微生物高效表達系統(tǒng)(如: 大腸桿菌、畢赤酵母表達系統(tǒng))大量表達了有機磷水解酶,表達量相對原始菌株明顯提高。 但在原核表達系統(tǒng)中,因既不能對表達的蛋白進行翻譯后的加工,也不能對表達蛋白進行 糖基化修飾,所以經(jīng)常導(dǎo)致表達的蛋白沒有活性;另外,蛋白質(zhì)的表達量不高,且胞內(nèi)表達 雜蛋白較多,不易純化,達不到廉價大規(guī)模生產(chǎn)的目的,所以實用性有限。酵母具有微生物 和真核生物的雙重特點,它可以對體內(nèi)表達的異源蛋白進行修飾,當(dāng)采用酵母信號肽時,蛋 白能被正確折疊和加工,然后分泌到培養(yǎng)基中。相對原核表達系統(tǒng)而言,真核酵母表達系統(tǒng) 表達的酶表達量高且容易純化,目前已經(jīng)有多種蛋白利用酵母表達系統(tǒng)進行了大規(guī)模工業(yè) 化生產(chǎn)。其中畢赤酵母表達系統(tǒng)是目前工業(yè)化生產(chǎn)蛋白酶常見的表達系統(tǒng),畢赤酵母表達 系統(tǒng)主要有以下特點:①具有強有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase,A0X1)基因啟動子, 可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達;②作為真核表達系統(tǒng),可對表達的蛋白進行翻譯后的加工與 修飾,從而使表達出的蛋白具有生物活性;③營養(yǎng)要求低、生長快、培養(yǎng)基廉價,便于工業(yè)化 生產(chǎn);④可高密度發(fā)酵培養(yǎng),在發(fā)酵罐中細胞干重甚至可達120g/L以上;⑤表達量高,許多 蛋白可達到克級每升以上水平。初曉宇等將假單胞菌來源的有機磷水解酶基因0phc2克隆 并整合到畢赤酵母基因組中,成功實現(xiàn)該酶的異源表達,3L高密度發(fā)酵表達量達到5. 5g/ L0
[0004] 隨著分子生物學(xué)研究的飛速發(fā)展,各種基因工程操作技術(shù)的迅速出現(xiàn),如今合成 生物學(xué)已經(jīng)發(fā)展成為一門熱門學(xué)科,并且被應(yīng)用到科研和工業(yè)生產(chǎn)中。Biobricks技術(shù)是近 年發(fā)展出來的一種廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)中的重組DNA的方法,其實質(zhì)是通過基因片段的 巧妙拼接實現(xiàn)DNA片段重組。本發(fā)明中即采用Biobricks技術(shù),將有機磷水解酶基因巧妙 拼接,獲得有機磷水解酶基因多拷貝畢赤酵母表達載體,并成功整合至酵母基因組,獲得表 達量達到8. lg/L的有機磷水解酶重組菌株,為工業(yè)化大規(guī)模廉價生產(chǎn)有機磷水解酶奠定 了基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0005] 本發(fā)明的目的是首先根據(jù)酵母密碼子偏愛性,人工優(yōu)化合成有機磷水解酶基因 (OphcM),然后構(gòu)建并篩選多拷貝有機磷水解酶基因畢赤酵母高效表達菌株,最后通過高密 度發(fā)酵的方法提高單位體積的有機磷水解酶產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本,為該酶的大規(guī)模工業(yè)化 生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明的步驟為:
[0007] 1、優(yōu)化合成有機磷水解酶基因(OphcM)
[0008] 將來源于Pseudomonas pseudoalcaligenes 的有機憐水解酶基因 0phc2 (Genebank ID :AJ605330. 1,其中,基因長度為906bp,編碼301個氨基酸)進行改造,在不改變原氨基 酸編碼序列的原則下,按照酵母密碼子偏愛性對其進行優(yōu)化,采用套疊 PCR的方法進行基 因合成,優(yōu)化改造的基因序列見圖1,命名為OphcM。優(yōu)化后的核酸序列與原始核酸序列相 比,253個核酸發(fā)生改變,改造前后核苷酸序列相比,同源性為72. 08%,同時為了使有機磷 水解酶在畢赤酵母中高效穩(wěn)定地分泌表達,優(yōu)化后的有機磷水解酶基因去掉了編碼5'端信 號肽序列的22氨基酸(詳見圖2的第2至23)。
[0009] 2、多拷貝有機磷水解酶畢赤酵母表達載體的構(gòu)建過程
[0010] 將有機磷水解酶基因 OphcM兩端引入酶切位點Cop I和Not I,并克隆到畢 赤酵母高效表達載體PHBM905BDM(專利公開號CN103555749A)中,獲得單拷貝表達載 體BDM-OphcM-IC ;然后采用傳統(tǒng)的基因工程操作技術(shù),分別通過限制酶EcoR I、Xba I、Spe I和BamH I的酶切,先后獲得多拷貝表達載體BDM-〇phcM-2C、BDM-〇phcM-3C、 BDM-0phcM-4C。載體構(gòu)建具體過程如圖4。
[0011] 3、構(gòu)建多拷貝有機磷水解酶基因畢赤酵母表達重組菌株
[0012] 將上述多拷貝表達載體BDM-〇phcM-2C、BDM-〇phcM-3C、BDM-0phcM-4C采用化學(xué)轉(zhuǎn) 化法,分別轉(zhuǎn)化到Pichia pastoris GS115Mut+中,通過在MD平板上生長,并采用菌落PCR 的方法進行驗證,然后搖瓶發(fā)酵,具體方法為:將轉(zhuǎn)化后重組菌株接種到BMGY培養(yǎng)基中在 28°C培養(yǎng)48h后,離心去上清將細胞轉(zhuǎn)移到BMMY培養(yǎng)基中,每24h取樣并用1 %的甲醇進 行誘導(dǎo)。樣品離心去除沉淀,用上清跑SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達情況,并用上清與 底物甲基對硫磷反應(yīng),檢測表達產(chǎn)物是否有活性。通過以上篩選方法分別獲得單拷貝、二 拷貝、三拷貝、四拷貝的重組菌株,分別命名為Pichia pastoris OphcMUPichia pastoris 0phcM2、Pichia pastoris 0phcM3、Pichia pastoris 0phcM4〇
[0013] 4、將篩選到的多種重組菌株,分別進行搖瓶發(fā)酵,在相同的培養(yǎng)條件下,保證菌體 量基本一致的前提下,通過多次搖瓶試驗,比較1-4拷貝的重組酵母表達量和酶活,其中, Pichia pastoris OphcM2菌株的表達量和活性最高,如圖6所示。
[0014] 5、將重組酵母高密度發(fā)酵,制備生產(chǎn)有機磷水解酶;其中包括種子培養(yǎng)、菌體生長 階段、碳源飼喂階段和甲醇誘導(dǎo)表達階段等四個常規(guī)發(fā)酵生產(chǎn)酶的步驟。
[0015] 使用本發(fā)明將重組酵母Pichia pastoris 0phcM2菌株在5升發(fā)酵罐發(fā)酵144小 時表達量達8. 1克/升,在發(fā)酵96小時,酶比活達到12. 85U/mL,均明顯高出目前現(xiàn)有技術(shù) 數(shù)據(jù)。
[0016] 所述Pichia pastoris 0phcM2菌株于2015年03月20號保藏于武漢大學(xué)中國 典型培養(yǎng)物保藏中心,名稱為畢赤巴斯德酵母工程菌Pichia pastoris/0phcM2,保藏號: CCTCC N0:M2015140,以下簡稱 0phcM2。
[0017] 0phcM2菌株的菌學(xué)特性:
[0018] A、形態(tài)特征:畢赤酵母屬菌種細胞呈球形、橢圓形、拉長形,偶爾呈錐形,但不形成 尖頂。菌落顏色為乳白色或奶油色。無性繁殖方式為多邊芽殖。
[0019] B、生理生化特征:畢赤酵母能利用甲醇,石油,銨鹽等特殊物質(zhì)生長,最適生長溫 度為28°C -30°C。0phcM2除了具有畢赤酵母的生理生化外,其染色體上整合了有機磷水解 酶基因,在甲醇誘導(dǎo)條件下,能夠嚴(yán)格調(diào)控并高效分泌表達有機磷水解酶基因。(見背景技 術(shù)里的介紹)
【附圖說明】:
[0020] 圖1人工合成序列OphcM與原始序列0phc2對比圖,其中灰色區(qū)域代表同源序列
[0021] 圖2優(yōu)化的氨基酸序列與原始序列對比圖,其中灰色區(qū)域代表同源區(qū)
[0022] 圖3重組載體BDM-OphcM 1-4拷貝裝配及構(gòu)建過程
[0023] 圖4畢赤酵母高效表達載體pHBM905BDM物理圖譜及重組載體構(gòu)建過程
[0024] 圖5 BDM-OphcM 1-4拷貝重組表達載體多拷貝驗證,其中圖A所示為1-4拷貝質(zhì) 粒,圖B為所示為EcoR I和BamH I雙酶切驗證
[0025] 圖6 BDM-0phcMl-4拷貝表達量的SDS-PAGE電泳,其中,M為蛋白質(zhì)預(yù)染marker, 1-2 泳道依次為 Pichia pastoris OphcMU Pichia pastoris 0phcM2、Pichia pastoris 0phcM3、Pichia pastoris 0phcM4 搖瓶 6 天的上清
[0026] 圖7 Pichia pastoris 0phcM2菌株發(fā)酵的SDS-PAGE電泳圖,其中M為蛋白質(zhì)預(yù) 染marker,1-8泳道依次為發(fā)酵12h,24