一種用于重金屬鎘污染治理的無色桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境治理及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于重金屬鎘污染治理的無色 桿菌（Achromobactersp.)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 重金屬污染問題嚴(yán)重影響到了人類的健康，已成為目前最主要的環(huán)境問題之一。 鎘（Cd)在環(huán)境中和生物體內(nèi)具有穩(wěn)定積累和不易消除的特點(diǎn)。鎘迀移轉(zhuǎn)化的最大特點(diǎn)在 于不易被生物體分解轉(zhuǎn)化并排出體外，不易隨水移動(dòng)，而是沿食物鏈逐級往上傳遞并通過 富集作用使人體慢性中毒。鎘被國際癌癥研究中心（IARC)確認(rèn)為IA級致癌物，被美國毒 性物質(zhì)管理委員會（ATSDR)列為第六位危害人體健康的有毒物質(zhì)，在2014年公布的土壤污 染調(diào)查公報(bào)中顯示鎘污染已成為了我國當(dāng)前最為嚴(yán)重的土壤無機(jī)污染物。
[0003] 對重金屬污染的土壤及水體的處理方法有物理法、化學(xué)法、離子交換法、吸附法、 電解法、化學(xué)氧化還原法、電化學(xué)處理法、反滲透法和膜分離法等，這些方法存在能耗高，成 本高，技術(shù)繁瑣，甚至是易導(dǎo)致二次污染等缺陷，很難投入實(shí)際應(yīng)用中。近年來，重金屬污染 的生物修復(fù)技術(shù)正在興起，利用特定的生物（植物、微生物等）吸收、轉(zhuǎn)化、清除或降解環(huán)境 污染物，從而實(shí)現(xiàn)環(huán)境凈化、生態(tài)效應(yīng)恢復(fù)，該方法具有環(huán)境友好、原料容易獲取、能耗和成 本低等特點(diǎn)。
[0004] 土壤中的鎘的形態(tài)可分為水溶/交換態(tài)、有機(jī)結(jié)合態(tài)、無機(jī)結(jié)合態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)。鎘在 土壤中各種形態(tài)所占比例的不同，直接影響其在土壤中的迀移、轉(zhuǎn)化、吸附、解吸能力，以及 對生物的生理毒性。按照鎘對生物的毒性由高到低分別為：水溶態(tài)和交換態(tài)〉有機(jī)結(jié)合態(tài)〉 無機(jī)結(jié)合態(tài)〉殘?jiān)鼞B(tài)。土壤中Cd的存在形態(tài)受到其本身的性質(zhì)、含量、土壤組成結(jié)構(gòu)（如： 有機(jī)質(zhì)、碳酸鹽、礦物和微生物）和環(huán)境條件（如：PH，溫度和濕度等）的影響。隨著環(huán)境的 變化，Cd的各種形態(tài)之間是可以發(fā)生轉(zhuǎn)化的，且這種轉(zhuǎn)化行為在一定的體系中與一般的化 學(xué)平衡原理相似，如酸堿平衡、氧化還原、吸附解吸、配位平衡以及沉淀溶解之間的平衡。不 過，因?yàn)橥寥辣旧硎且粋€(gè)復(fù)雜的體系，這種轉(zhuǎn)化行為可能會更加復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于重金屬鎘污染治理的無色桿菌。
[0006] 申請人從鎘污染的土壤中分離得到了一株無色桿菌，通過生理生化和核糖體16S rDNA基因序列分析將其鑒定為無色桿菌屬（Achromobactersp.)，命名為無色桿菌H380。 該菌株已于2015年5月11日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中 心（CCTCC)保藏，保藏編號為：CCTCCN0:M2015291。該菌株能在高濃度重金屬離子的條件 下生長，并能顯著地降低環(huán)境中生物毒性鎘的含量，因此在重金屬鎘污染治理領(lǐng)域具有十 分重要的應(yīng)用前景。
[0007] 本發(fā)明所提供的無色桿菌H380菌株在0.5倍液體LB培養(yǎng)基條件下能夠耐受 12mmol/LMnCl2；12mmol/L Zn (NO 3) 2;6mmol/L CoCl 2;4mmol/L CuSO 4;8mmol/L Cd(N03)2以 及l(fā)mmol/L 1(2〇04;在M9培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下對上述重金屬的耐受濃度則分別為8mmol/L、8mmol/L、6mmol/L、4mmol/L、4mmol/L、0. 125mmol/L。同時(shí)，H380菌株能夠在含有氛節(jié)西 林（100mg/Kg);氯霉素（50mg/Kg);壯觀霉素（50mg/Kg);卡那霉素（50mg/Kg);慶大霉素 (20mg/Kg);新霉素（200mg/Kg);鏈霉素（5mg/Kg)的0.5倍LB與M9培養(yǎng)基中良好生長。以 上結(jié)果說明該菌株重金屬抗性譜廣，耐受能力強(qiáng)，同時(shí)具有多種抗生素抗性，環(huán)境生存能力 強(qiáng)，適應(yīng)性廣，是重金屬鎘污染治理的優(yōu)秀微生物材料。
[0008] 此外，在接種1%H380菌株的含有6mM的0. 5倍LB培養(yǎng)基中，該菌株能有效去除 70%游離鎘離子；向土壤中按107cfu/Kg的接種量接種，能夠明顯降低植物對鎘離子的攝入 量，促進(jìn)土壤中的游離鎘離子向結(jié)合態(tài)鎘離子轉(zhuǎn)化，從而降低其生物毒害性，實(shí)現(xiàn)土壤鎘污 染的治理。
【附圖說明】
[0009] 圖1為H380菌株在LB平板上的生長狀況的照片（A)和菌株的革蘭氏染色照片 ⑶。
[0010] 圖2為H380菌株在高鎘離子脅迫條件下的生長曲線圖。
[0011] 圖3為H380菌株在不同鎘離子脅迫條件下的生長狀況和鎘去除效率。
[0012] 圖4為不同鎘污染水平土壤中施加H380菌株對黑麥草吸收的總鎘量的影響。
[0013] 圖5為不同鎘污染土壤中施加H380菌株對土壤中鎘形態(tài)分布的影響。F1:水溶/ 交換態(tài)；F2 :有機(jī)結(jié)合態(tài)；F3 :無機(jī)結(jié)合態(tài)；F4 :殘?jiān)鼞B(tài)。 具體實(shí)施方案
[0014] 以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明。需要指出的是，本發(fā)明的實(shí)施例僅限 于對于本發(fā)明進(jìn)行說明，而沒有限制作用。本發(fā)明中所涉及的其它各種操作，均為本領(lǐng)域的 常規(guī)技術(shù)，文中沒有特別說明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請日之前 的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說明書、手冊等予以實(shí)施。
[0015] 實(shí)施例1無色桿菌H380的分離鑒定
[0016]采用來自湖北大冶礦區(qū)重金屬污染的土壤為篩選土壤，具體篩選方案如下：
[0017] (1)鎘抗性細(xì)菌H380的分離
[0018]A、稱取10g鎘污染土壤于90mL無菌生理鹽水中，在28°C恒溫?fù)u床上振蕩搖勻，靜 置后，取上清液進(jìn)行培養(yǎng)；
[0019]B、將上清液轉(zhuǎn)至無菌的0. 5倍LB(含200mg/L的Cd2+)中，置于28°C恒溫?fù)u床中培 養(yǎng)10天左右，再以10%接種量接種到含有300mg/LCd2+的0. 5倍LB培養(yǎng)基中，再在28°C 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)10天左右，然后再次以相同方法轉(zhuǎn)接到含有400mg/LCd2+的0. 5倍LB培 養(yǎng)基中培養(yǎng)10天左右。最后取〇. 2ml培養(yǎng)物，涂布到含有200mg/L的Cd2+的0. 5倍LB固 體平板中，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單菌落長出；挑取單菌落到含有200mg/L的Cd2+ 的0. 5倍LB液體培養(yǎng)基中，然后置于28°C恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)；
[0020] C、將平板上生長的微生物進(jìn)行劃線分離純化，然后重新涂布到上述含鎘的0. 5倍 LB平板上；
[0021] D、經(jīng)分離篩選后，保存對鎘具有穩(wěn)定抗性能力的菌株，在0. 5倍LB平板上進(jìn)行保 存，獲得本發(fā)明菌株，進(jìn)一步對菌株鑒定保存?zhèn)溆谩?br>[0022] (2)抗鎘細(xì)菌H380的生物學(xué)特性。
[0023] 短桿狀細(xì)菌，專性需氧，在0. 5倍LB固體培養(yǎng)基上孵育48小時(shí)后，菌落形態(tài)為白 色或乳白色，不透明，表面濕潤光滑并呈凸起狀，邊緣完整，革蘭氏陰性菌，不產(chǎn)芽胞。
[0024] (3)分子生物學(xué)鑒定。
[0025] 以分離獲得的菌株總DNA，用作PCR模板，以27F-1492R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增上述 菌株的16SrDNA序列，其序列如序列表SEQIDN0:1所示。以用于菌株的分子鑒定與 Achromobacter菌屬有99%的相似性。同時(shí)結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹和菌株形態(tài)學(xué)觀察確認(rèn)該菌為 無色桿菌（Achromobactersp.)。菌株在LB平板上的生長狀況的照片和菌株的革蘭氏染色 照片見圖1。
[0026] 實(shí)施例2無色桿菌H380的環(huán)境適應(yīng)特征
[0027] 申請人對無色桿菌H380對多種重金屬的耐受性及抗生素的抗性進(jìn)行了測試。
[0028] 將H380菌株接種到新鮮的0?5倍LB培養(yǎng)基中活化過夜，然后以1 % (v/v)的接 種量接種到新鮮的〇. 5倍LB培養(yǎng)基中，28°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)至0D_= 0. 5左右；然后以 1% (v/v)的接種量分別接種到含有不同錦咼子濃度的M9培養(yǎng)基以及0.5倍LB培養(yǎng)基 中，然后放入28°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3天后，取2ml培養(yǎng)物，6000rpm離心5分鐘，加入2ml 無菌生理鹽水懸浮后，測定0D6。。吸光值。同時(shí)，從培養(yǎng)物中取2ml培養(yǎng)物，在無菌條件下 6000rpm離心5分鐘，加入2ml無菌生理鹽水懸浮，然后用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，分別 取10 3, 10 4, 10 5三個(gè)稀釋度100微升涂布0. 5倍LB固體平板，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。若此時(shí)固體 培養(yǎng)條件下，無菌落形成，則可