一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及利用其進(jìn)行的人神經(jīng)干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，特別涉及一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及利用 其進(jìn)行的人神經(jīng)干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)擴(kuò)增方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1992年Reynolds and Weiss發(fā)現(xiàn)哺乳動物前腦有神經(jīng)干細(xì)胞，并能在體外培養(yǎng)擴(kuò) 增。神經(jīng)干細(xì)胞具有下列特性：1自我更新能力；2分化潛能：具有多向分化潛能，分化成神 經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞等三類細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和神經(jīng)退 行性疾病都有直接或間接的治療作用，因此大量培養(yǎng)擴(kuò)增人神經(jīng)干細(xì)胞具有巨大的應(yīng)用價 值。
[0003] 用胰蛋白酶消化傳代神經(jīng)干細(xì)胞的常規(guī)方法培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量較少，難以獲 得供臨床使用的大量神經(jīng)干細(xì)胞。目前采取的辦法是需要獲得多個胚胎或胎兒進(jìn)行多次培 養(yǎng)擴(kuò)增才能獲得大量神經(jīng)干細(xì)胞，這不但造成胚胎或胎兒源的貧乏，而且每一個胚胎或胎 兒之間都存在差異，神經(jīng)干細(xì)胞來源十分混雜，難以統(tǒng)一，更無法達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其可用于人神經(jīng)干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)擴(kuò)增。
[0005] 本發(fā)明還提供一種所述利用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行的人神經(jīng)干細(xì)胞體外長期培 養(yǎng)擴(kuò)增方法，該方法解決了人神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)易分化和難以長期培養(yǎng)擴(kuò)增的技術(shù)難 題。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0007] -種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，該神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基包括以下重量配比的組分：
[0008] 肝索銷（lieparin) 100-1000j.ig 維牛.索E(VilamitK'E,VE) 10-100(.ig 人重組胰島素(Insulin) 5-50tng 腐胺(Putrescine) 0.5-5mg H!酸納(SodiumSelenidc'} 2-10fig 人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin) 2-10mg
[0009] 邊體H(Progcslctonc) 2-10j.ig L--艦胺(L-Gluiamine) 300mg 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES) 5.9g 人重組表皮生長因子（rhEGF) lO-lOO^ig 人重組堿性成纖維生長因子（rhbFGF) 10-100(ig 維生素C葡萄糖苷 20-200 mg: )欠人符合、.(Genienmycin) 40000-400000 1U 〇
[0010] 作為優(yōu)選，該神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基包括以下重量配比的組分：
[0011] 肝索鈉（heparin) 20〇i，ig 維屮索E(VitamineE，VE) 紐座 人1P:組胰島素(Insulin) 25mg 腐胺(丨)ulrescine) 1.6mg 、丨設(shè)鈉(SodiumSelenide) 6ug 人的鐵擊丨'l(Translbrrin) 5,5mg 黃體酮(Progesterone) 7j.ig L-?rSt!K(L-GIulamine) 300-3IOmg 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES) 5.8-6.0g 人重組表皮生長因子（rhEGF) 20|ig 人重組堿性成纖維生長因子（rhbFGF) 20jig 維生素C葡萄糖苷 50mg 慶大.符:秦(Gentenraydn) 40000IU 〇
[0012] 作為優(yōu)選，該神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法為：取12gDMEM/F12培養(yǎng)基與1000mL 無菌去離子水混合，加入4-羥乙基哌嗪乙磺酸攪拌均勻制成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，使溶液pH值控制 在7. 0~7. 1 ;然后加入余下各組分混勻即可。
[0013] 作為優(yōu)選，該神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值為6. 90~7. 10。
[0014] 一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，該方法是：取12gDMEM/F12培養(yǎng)基與1000mL 無菌去離子水混合，加入4-羥乙基哌嗪乙磺酸攪拌均勻制成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，使溶液pH值控制 在7. 0~7. 1 ;然后加入余下各組分混勻即可。
[0015] -種利用所述的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行人神經(jīng)干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)擴(kuò)增方法，該 方法是：采用所述神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，細(xì)胞瓶置于5%C02、37°C溫度培養(yǎng)箱中 進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞增殖情況，每3-4天半量更換神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基一次；神經(jīng)干細(xì)胞在神 經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)20-30天，神經(jīng)干細(xì)胞的干細(xì)胞球直徑為500-1000微米時，把 含有干細(xì)胞球的培養(yǎng)基用100-200ml注射器吸入，經(jīng)干細(xì)胞球切割器切割，使每1個神經(jīng)干 細(xì)胞球切割成3-8小塊，每塊為30-200微米，切成小塊的干細(xì)胞團(tuán)放到新培養(yǎng)瓶中，并加入 一半新配制的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基和另一半使用后的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基互相混合，按1:2或 1:4比例分瓶傳代繼續(xù)培養(yǎng)。
[0016] 作為優(yōu)選，所述的干細(xì)胞球切割器為不銹鋼篩網(wǎng)，不銹鋼篩網(wǎng)的孔徑為 100ym-320ym?？讖降拇笮「鶕?jù)培養(yǎng)情況和需要分割的小塊個數(shù)進(jìn)行選擇。
[0017] 用發(fā)明人經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)合理配制神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液結(jié)合干細(xì)胞球切割器的 分離傳代培養(yǎng)法，對細(xì)胞本身沒有任何損害，這對長期培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞極其有利。本發(fā)明解 決了體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞易分化和易死亡的技術(shù)難題，達(dá)到長期規(guī)?；囵B(yǎng)人神經(jīng)干細(xì)胞 的目的，而且經(jīng)這種方法培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞的基因穩(wěn)定，質(zhì)量可控，為廣泛應(yīng)用于臨床提 供重要的、用之不竭的神經(jīng)干細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了其它特殊成分：肝素鈉、維生素E、維生素C 葡萄糖苷、慶大霉素等。
[0019] 特殊成分的作用機(jī)理說明：
[0020] ①肝素
[0021] 肝素是一類由糖醛酸和氨基己糖組成的聚陰離子糖胺聚糖類大分子，其分子量約 5000Da(3000-8000Da)。它具有抗凝血、抗血栓、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等作用；能降低 血黏稠度，增加脂蛋白酶的活性，增加極低密度脂蛋白和甘油三脂的分解，從而降低血中極 低密度脂蛋白、甘油三脂、低密度脂蛋白、總膽固醇。此外，肝素有下列特殊作用：1)可以與 許多種蛋白質(zhì)結(jié)合，增強(qiáng)蛋白質(zhì)作用；2)促進(jìn)干細(xì)胞增殖作用；3)能夠間接抑制神經(jīng)元，間 接地達(dá)到抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化作用，有利于長期神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)。
[0022] ②維生素E(VE)
[0023] 維生素E對神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。維生素E除了通過抗氧化機(jī)制發(fā)揮作用外， 還可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性機(jī)制及調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)機(jī)制發(fā)揮作用。此外，低劑量維生素E 長期使用對細(xì)胞增殖無不良影響，而大劑量長期使用維生素E有抑制細(xì)胞增殖作用，所以， 本發(fā)明選用小劑量長期使用維生素E，結(jié)果非常好，即對長期培養(yǎng)擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞有輔助作 用。此外，維生素E具有對抗慶大霉素的毒性作用。
[0024] ③維生素C葡萄糖苷
[0025] 維生素C具有抗氧化作用，但是普通維生素C自身很容易被氧化，容易失效，所以 為了保護(hù)維生素C的活性，做成維生素C葡萄糖苷（VC糖苷）衍生物，以保護(hù)維生素C的活 性。在長期培養(yǎng)中細(xì)胞代謝中不斷產(chǎn)生自由基和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，VC糖苷通過抑制氧化反 應(yīng)減少自由基的合成，延長細(xì)胞的壽命。VC糖苷與天然維生素C相比溶解性更好，在很多 pH值環(huán)境中都比較穩(wěn)定。
[0026] ④慶大霉素（Gentenmycin)
[0027] 本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中不加入青霉素或鏈霉素，因?yàn)榍嗝顾睾玩溍顾氐倪^ 敏性、腎毒性、耳毒性等副作用，限制了細(xì)胞的正常使用。慶大霉素能與細(xì)菌核糖體30s亞 基結(jié)合，阻止細(xì)菌生長。同時，它對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、克雷白桿菌等十 多種細(xì)菌有光譜抗菌作用，并且具有熱穩(wěn)定性的優(yōu)勢。慶大霉素對腎毒性和/或耳毒性的 副作用與聯(lián)合使用其他氨基糖苷類、多粘菌素類、頭孢噻吩、神經(jīng)肌肉阻滯藥有關(guān)，但是即 使單獨(dú)長期使用慶大霉素也可能產(chǎn)生毒性作用，但添加維生素E后，可以消除慶大霉素的 副作用。在體外長期培養(yǎng)中，慶大霉素對長期培養(yǎng)擴(kuò)增人神經(jīng)干細(xì)胞起到防止細(xì)菌污染作 用，同時添加維生素E和bFGF對干細(xì)胞的生長有利，而且可以減輕或?qū)箲c大霉素的毒副 作用。
[0028] 本發(fā)明培養(yǎng)液組分中胰島素作用是通過促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸，從而促進(jìn) 細(xì)胞分裂、生長。腐胺能夠刺激和誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞生長和增殖。亞硒酸鈉促進(jìn)和參與神經(jīng) 干細(xì)胞代謝。人轉(zhuǎn)鐵蛋白可結(jié)合鐵離子，使神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞合理利用鐵離子，并減少其對細(xì) 胞的毒性，從而維持細(xì)胞正常狀態(tài)。黃體酮具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長和調(diào)節(jié)作用。HEPES是 維持細(xì)胞液中酸堿平衡作用。
[0029] 本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基能夠使人神經(jīng)干細(xì)胞在體外長期（>30個月）培養(yǎng)擴(kuò) 增，大量擴(kuò)增后神經(jīng)干細(xì)胞遺傳穩(wěn)定。本發(fā)明很好地解決了人神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)易分化 和難以長期培養(yǎng)擴(kuò)增的技術(shù)難題，從而為臨床應(yīng)用提供來源和標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的、用之不竭的大 量神經(jīng)干細(xì)胞，用于防治神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性疾病、藥物篩選、干細(xì)胞定向分化和毒理 學(xué)、藥理學(xué)以及其它應(yīng)用學(xué)等科學(xué)研究中。
【附圖說明】
[0030] 圖1是本發(fā)明的人神經(jīng)干細(xì)胞球顯微照片（40倍