一種聚乙烯亞胺金屬配位固定化的多酶體系及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種聚乙烯亞胺金屬配位固定化的多酶體系及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 二羥基丙酮（Dihydroxyacetone)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的制備，可用來(lái) 合成雜環(huán)化合物、甘油三酯、酮位取代化合物。二羥基丙酮可作防曬化妝品的組成成分。 在微生物代謝轉(zhuǎn)化甘油為二羥基丙酮的氧化途徑中，甘油在依賴于NAD+的甘油脫氫酶 (Glyceroldehydrogenase，簡(jiǎn)稱⑶H，EC1.1. 1.6)的作用下形成二羥基丙酮。甘油脫氫酶 在醫(yī)學(xué)診斷分析中也得到廣泛應(yīng)用，例如用于酶法分析血脂含量。
[0003] 在氧化還原酶催化過(guò)程中，輔酶的再生利用至關(guān)重要，在二羥基丙酮的酶法生產(chǎn) 中，使用輔酶氧化酶輔助輔酶再生，可以實(shí)現(xiàn)輔酶的循環(huán)利用，從而降低酶法生產(chǎn)二羥基丙 酮的成本。利用固定化多酶耦聯(lián)體系催化合成二羥基丙酮，較微生物發(fā)酵法和化學(xué)法具有 反應(yīng)效率高，操作簡(jiǎn)易，有利于連續(xù)反應(yīng)和下游分離等優(yōu)點(diǎn)，有利于此技術(shù)的工業(yè)化推廣。
[0004] 聚乙稀亞胺（Polyethyleneimine，簡(jiǎn)稱PEI)是一種水溶性聚胺，大分子鏈上具有 大量氨基。當(dāng)pH〈10時(shí)，其分子鏈上的氨基多處于質(zhì)子化狀態(tài)，是一種帶正電荷的聚電解 質(zhì)。大部分酶在pH〈10時(shí)帶負(fù)電，因此聚乙烯亞胺在該條件下對(duì)酶分子具有靜電吸附作用， 從而實(shí)現(xiàn)固定化。Palomo等人曾用聚乙稀亞胺修飾的Sepabeads樹脂固定化脂肪酶用于扁 桃酸甲酯的水解，結(jié)果表明固定化酶的對(duì)映體選擇性優(yōu)于游離酶；CesarMateo等人用聚乙 烯亞胺制備可以重復(fù)回收使用的固定化載體，實(shí)現(xiàn)酶的可逆固定化。
[0005] 基于靜電相互作用的聚乙烯亞胺固定化酶的方法作用力較弱，需增強(qiáng)酶與PEI之 間的作用力。戊二醛是傳統(tǒng)的固定化方法中采用較為廣泛的交聯(lián)劑，應(yīng)用于脂肪酶、蛋白 酶、半乳糖苷酶等的固定化上。由于戊二醛交聯(lián)形成共價(jià)鍵，對(duì)于易失活的氧化還原酶容易 造成酶活性大幅度下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明利用聚乙烯亞胺金屬配位固定化甘油脫氫酶和輔酶氧化酶，以及甘油脫氫 酶-輔酶氧化酶融合酶，人工構(gòu)建體外多酶耦聯(lián)體系，提高多酶體系的穩(wěn)定性與催化效率， 并且實(shí)現(xiàn)輔酶的循環(huán)再生。包括以下步驟：
[0007] 1)工程菌的構(gòu)建：構(gòu)建帶有組氨酸標(biāo)簽的甘油脫氫酶基因、帶有組氨酸標(biāo)簽的輔 酶氧化酶基因，并利用上述兩基因構(gòu)建帶有組氨酸標(biāo)簽的甘油脫氫酶-輔酶氧化酶融合酶 基因，用BamHI和xholI分別雙酶切上述基因及pET32a質(zhì)粒，用T4DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化 大腸桿菌（DH5a)，然后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)制備可表達(dá)甘油脫氫酶、可表達(dá) 輔酶氧化酶、可表達(dá)甘油脫氫酶-輔酶氧化酶融合酶的工程菌；
[0008] 2)粗酶液制備：將步驟1)得到的工程菌接種到含有氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代-0-D-半乳糖苷（簡(jiǎn)稱IPTG);培養(yǎng)所得發(fā)酵 液在冷凍離心機(jī)中離心獲得細(xì)胞，用緩沖液重懸、洗滌，配制成細(xì)胞液；超聲破碎，將破碎液 離心，收集上清液即為粗酶液；
[0009] 3)純酶的制備：采用鎳柱對(duì)步驟2)得到的粗酶液進(jìn)行純化并利用Tris-HCl緩沖 液（pH6. 5~8. 0)超濾除鹽，得到甘油脫氫酶、輔酶氧化酶、甘油脫氫酶-輔酶氧化酶融合 酶；
[0010] 4)聚乙烯亞胺-金屬溶液制備：配置濃度為5~200mg/ml的聚乙烯亞胺溶液， 向該溶液中加入金屬鹽溶液并使其終濃度為〇. 05~50mmol/L，配成混合溶液，4°C保溫 0. 5~4h，離心除去上清，沉淀重懸于1~100mmol/L的pH6. 0~8. 0的磷酸緩沖液或1~ 100mmol/L的pH8. 0~10的氨水-氯化銨緩沖液中，得到聚乙烯亞胺-金屬溶液；
[0011] 5)固定化多酶體系制備：將含有步驟3)中得到的甘油脫氫酶、輔酶氧化酶、甘油 脫氫酶-輔酶氧化酶融合酶的酶濃度為〇. 〇5mg/ml~10mg/ml的酶溶液加入至步驟4)中 獲得的聚乙烯亞胺-金屬溶液，同時(shí)不斷攪拌孵化，形成固定化顆粒，離心分離，沖洗，重懸 于0. 05M的pH7. 0的Tris-HCl緩沖液或0. 05~0. 1M的pH8. 0~10. 0的氨水-氯化銨緩 沖液中，即得聚乙烯亞胺金屬配位固定化多酶體系。
[0012] 其中，所述步驟1)中，帶有組氨酸標(biāo)簽的甘油脫氫酶、帶有組氨酸標(biāo)簽的輔酶氧 化酶、帶有組氨酸標(biāo)簽的甘油脫氫酶-輔酶氧化酶融合酶基因的核苷酸序列分別如SEQID NO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3 所示。
[0013] 其中，所述步驟1)中，接種量為1~3%，所述的LB培養(yǎng)基的組成為：胰蛋白胨 5. 0~15. 0g/L，酵母粉1. 0~10. 0g/L，NaCl0. 0~15. 0g/L，接種前添加氨芐霉素使其終 濃度為50~150yg/mL;所述培養(yǎng)條件為：起始pH7. 0~7. 5,培養(yǎng)溫度37°C，150~250 轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)4~6h后加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為5~15mg/ml，繼續(xù)在25~30°C， 150~250rpm下培養(yǎng)1. 5~3h;培養(yǎng)所得的發(fā)酵液，在冷凍離心機(jī)中4°C，8000rpm離心 15min獲得細(xì)胞，棄上清液，沉淀用Tris-鹽酸緩沖液（pH6. 5~8. 0)重懸，充分洗滌后離 心，重復(fù)操作3次，獲得細(xì)胞，配置濃度為50~150g/L的細(xì)胞液，利用超聲破碎儀對(duì)細(xì)胞液 進(jìn)行處理，將制備的細(xì)胞懸液置于冰浴中，細(xì)胞破碎儀探頭置于液面下1厘米，功率200W， 超聲2秒，間隔4秒，超聲20~60次。然后4°C、12000rpm將破碎液離心15min去除不溶 性細(xì)胞碎片，收集上清即為粗酶液。
[0014] 其中，所述步驟3)中，純化過(guò)程采用的純化柱為能夠特異性純化帶有His-tagged 標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的HisTrap HP鎳柱，其步驟包括平衡、上樣、平衡、洗脫、柱子再生；收集洗脫 的部分并利用超濾離心管進(jìn)行除鹽，除鹽后獲得的液體即為純酶溶液。
[0015] 其中，所述步驟4)中，聚乙烯亞胺包括分子量20~500KDa的直鏈PEI(優(yōu)選為 分子量為22KDa，87KDa，217KDa)與分子量20~500KDa的支鏈PEI(優(yōu)選分子量為25KDa， 187KDa)兩種。
[0016]其中，所述步驟4)中，使用的金屬鹽為CuCl2、NiCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、CaCl2、 CoCl2、TiCl4〇
[0017] -種根據(jù)上述的制備方法所制備的聚乙烯亞胺金屬配位固定化多酶體系。
[0018] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0019] 本發(fā)明選用聚乙烯亞胺作為固定化骨架，利用金屬離子在聚乙烯亞胺分子以及重 組酶的組氨酸標(biāo)簽之間的配位作用力，實(shí)現(xiàn)酶的高效穩(wěn)定固定化，從而制備聚乙烯亞胺金 屬配位固定化多酶體系。金屬離子不僅在固定化過(guò)程中起配位交聯(lián)作用，還可提高多酶體 系的催化效率。本發(fā)明所獲得的聚乙烯亞胺金屬配位固定化多酶體系具有操作方法簡(jiǎn)單， 固定化迅速，溫度穩(wěn)定性高及重復(fù)使用穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，并能提高酶的催化能力和多酶體 系的協(xié)同作用。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0021] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例一所制備的聚乙烯亞胺金屬配位固定化輔酶氧化酶的表面 掃描電鏡（SEM)圖。
[0022] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例一所制備的聚乙烯亞胺金屬配位固定化輔酶氧化酶的溫度 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)變化圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為相對(duì)酶活，N0X+Mn2++PEI為聚乙烯亞胺金 屬配位固定化輔酶氧化酶，N0X為游離酶。
[0023] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例二所制備的聚乙烯亞胺金屬配位固定化甘油脫氫酶的表面 掃描電鏡（SEM)圖。
[0024] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例二所制備的聚乙烯亞胺金屬配位固定化甘油脫氫酶的溫度 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)變化圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為相對(duì)酶活，PEI+Mn2++GDH為聚乙烯亞胺金 屬配位固定化甘油脫氫酶，GDH為游離酶。
[0025] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例三所制備的聚乙烯亞胺金屬配位固定化甘油脫氫酶-輔酶氧 化酶融合酶多酶耦聯(lián)體系的表面掃描電鏡（SEM)圖。
[0026]圖6為本發(fā)明實(shí)例三所制備的聚乙烯亞金屬配位固定化甘油脫氫酶-輔酶氧化酶 融合酶多酶耦聯(lián)體系與游離酶體系催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的轉(zhuǎn)化率對(duì)比圖，其中縱坐標(biāo) 為轉(zhuǎn)化率，PEI-Mn-GDH-NOX為聚乙烯亞金屬配位固定化甘油脫氫酶-輔酶氧化酶融合酶多 酶親聯(lián)體系，F(xiàn)reecoupling為游離酶體系。
[0027] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例四所制備的聚乙烯亞胺金屬配位固定化甘油脫氫酶和輔酶 氧化酶耦聯(lián)體系的表面掃描電鏡（SEM)圖。
[0028] 圖8為本發(fā)明實(shí)例四所制備的聚乙烯亞胺金屬配位固定化甘油脫氫酶和輔酶氧 化酶耦聯(lián)體系與游離酶體系催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的轉(zhuǎn)化率對(duì)比圖，其中縱坐標(biāo)為轉(zhuǎn)化 率，PEI-Ca-GDH-NOX為聚乙烯亞金屬配位固定化甘油脫氫酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系，F(xiàn)ree coupling為游離酶體系。
[0029]圖9為本發(fā)明所使用的二羥基丙酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0030] 圖10為本發(fā)明所使用的甘油檢測(cè)的液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容：
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 1)工程菌的構(gòu)建：PCR法構(gòu)建如SEQIDN0. 2所述的帶有組氨酸標(biāo)簽的輔酶氧化 酶基因，用BamHI和xholI分別雙酶切上述基因及pET32a質(zhì)粒，用T4DNA連接酶連接轉(zhuǎn) 化大腸桿菌（DH5a)，然后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)制備可表達(dá)輔酶氧化酶N0X的 工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a;所述輔酶氧化酶基因的原始序列來(lái)源于Lactobacillus brevis；
[0034] 2)粗酶液