密碼子優(yōu)化型1型鴨甲肝病毒vp1基因及其重組蛋白的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種密碼子優(yōu)化型VP1基因及其重組蛋白的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis)為主要由1型鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus typel，DHAV-1)引起的雛鴨的一種急性、高度致病性傳染病，發(fā)病急， 傳播迅速，病程短，死亡率高。臨床表現(xiàn)角弓反張，剖檢見肝臟腫大和大量的出血性斑點，是 危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。雖然我國研制的鴨肝炎雞胚化弱毒疫苗和滅活苗，在全國應(yīng) 用推廣，對種鴨、雛鴨進行免疫預(yù)防，取得很好的效果，然而，對DHAV-1特異性抗體的監(jiān)測 是評價DHAV-1弱毒疫苗和滅活苗免疫效果及制定合理免疫程序的關(guān)鍵，也是確認DHAV-1 感染的手段之一。目前，用于DHAV-1抗體檢測的方法主要有中和試驗（neutralization test，NT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、瓊脂凝膠 擴散試驗、Dot-ELISA測定法、間接血凝及血凝抑制試驗等。其中經(jīng)典的方法是血清中和試 驗，但其敏感性不夠理想，且耗時費力，不適于大批量血清樣品的檢測。ELISA具有特異性 強、敏感度高、快速準確、易于操作等特點，是DHAV-1感染早期快速診斷和免疫抗體監(jiān)測的 有效手段，但檢測過程耗時費力。
[0003] DHAV-1病毒主要由衣殼和核酸組成。生物信息學(xué)分析表明，基因組由5'端非編碼 區(qū)、一個大的開放閱讀框、及3'端非編碼區(qū)組成。0RF編碼含2249個氨基酸的多聚蛋白，編 碼的多聚蛋白在病毒包裝過程中，先進行自我切割，最終裂解為3種結(jié)構(gòu)蛋白（VPO、VP3和 VP1)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（24、28、2(：、3六、38、3(：和30)。其中，￥?1全長71牝口，編碼238個氨 基酸，是DHAV-1最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一。對其他小RNA病毒的研究表明，VP1蛋白位于病 毒最外部，是病毒中占有優(yōu)勢的表面結(jié)構(gòu)蛋白，含有多個抗原表位和關(guān)鍵的抗原決定簇，能 誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，從而產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因而被認為是檢測感染該病毒的最可靠的指 示器。劉明等建立了以VP1蛋白作為包被抗原的ELISA檢測方法。因此，VP1蛋白可作為 研制新型疫苗和診斷抗原的候選分子，對于鴨肝炎病毒的診斷具有重大作用。但采用大腸 桿菌原核表達蛋白時，常常遇到由于密碼子的偏嗜性問題而影響重組蛋白的表達和表達蛋 白的活性低而影響應(yīng)用等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種密碼子優(yōu)化型VP1基因及其重組蛋白，基 于該重組蛋白制備的膠體金免疫層析試紙在檢測DHAV-1抗體方面具有操作簡單，靈敏度 高，特異性好等特點。
[0005] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0006] 1、1型鴨甲肝病毒密碼子優(yōu)化型VP1基因（optiVPl)，核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示。
[0007] 優(yōu)選的，所述基因為針對大腸桿菌表達進行密碼子優(yōu)化獲得的VP1基因。
[0008] 2、1型鴨甲肝病毒密碼子優(yōu)化型VP1基因編碼的重組蛋白在制備檢測I型鴨甲肝 病毒抗體的膠體金免疫層析試紙中的應(yīng)用。
[0009] 3、膠體金免疫層析試紙，由底板、硝酸纖維素膜、樣品墊、金標墊和吸收墊組成，所 述硝酸纖維素膜上的測試線由濃度彡l.〇mg/ml的所述optiVPl基因編碼的重組蛋白包被 而成，質(zhì)控線由濃度彡〇. 4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金標墊由膠體金標記的濃度 彡0? 06mg/ml的optiVPl基因編碼的重組蛋白和膠體金標記的濃度彡0? 05mg/ml的A抗B IgG包被而成；所述A抗BIgG為免疫學(xué)研究中常規(guī)實驗動物中除鴨外的任一種動物抗另 一種任一種動物IgG。
[0010] 優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜上的測試線由濃度為1. 〇mg/ml的optiVPl基因編碼 的重組蛋白包被而成，質(zhì)控線由濃度為0. 4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金標墊由 膠體金標記的濃度為〇. 〇6mg/ml的optiVPl基因編碼的重組蛋白和膠體金標記的濃度為 0? 05mg/ml的A抗BIgG包被而成。
[0011] 優(yōu)選的，所述A抗B IgG為羊抗兔IgG。
[0012] 4、膠體金免疫層析試紙的制備方法，包括如下步驟：
[0013] (1)硝酸纖維素膜上質(zhì)控線和測試線的噴制：將optiVPl基因編碼的重組蛋白點 于硝酸纖維素膜上形成測試線，將A抗B IgG包被于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線，37°C干燥 后低溫密封保存；
[0014] (2)金標墊的制備：將膠體金標記的optiVPl基因編碼的重組蛋白和膠體金標記 的A抗B IgG均勻地噴涂于玻璃纖維素膜上，4°C凍干后低溫密封保存；
[0015] (3)試紙的組裝：分別將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸收墊依次粘在底板 上，硝酸纖維素膜上所述質(zhì)控線一端靠近吸收墊，所述測試線一端靠近金標墊，切割成試紙 條后，干燥密封低溫保存。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中所述測試線和質(zhì)控線之間的距離為0. 6cm，測試線和質(zhì)控 線距硝酸纖維素膜邊緣0. 2cm。
[0017] 優(yōu)選的，所述步驟（2)中所述膠體金標記重組蛋白和A抗B IgG時，金標重組蛋白 的最佳標記pH為每毫升金溶液加入8yl 0. 2mmol/L K2C03溶液，最佳標記量為每毫升金溶 液標記12yg重組蛋白；金標A抗B IgG的最佳標記pH為每毫升金溶液加入6yl 0. 2mmol/ L K2C03溶液，最佳標記量為每毫升金溶液標記10ygA抗B IgG。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過優(yōu)化密碼子獲得了密碼子優(yōu)化型VP1基因， 將該密碼子優(yōu)化型VP1 (optiVPl)基因的重組蛋白制備成膠體金試紙，并將其用于檢測I型 鴨甲肝病毒抗體，獲得了性能更高的檢測DHAV-1抗體的膠體金試紙。本發(fā)明使用密碼子優(yōu) 化型VP1 (optiVPl)基因的重組蛋白作檢測試劑可克服使用全病毒作為檢測試劑時由于受 病毒培養(yǎng)困難（操作復(fù)雜，成本高）和純度有限（會不同程度摻雜有許多宿主細胞成分） 等方面的技術(shù)限制而導(dǎo)致的成本高、穩(wěn)定性差、難以標準化、檢測結(jié)果的準確性差（如摻雜 的宿主細胞成分有可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)）等不足；本發(fā)明所述試紙條敏感性高，將 DHAV-1弱毒疫苗免疫鴨的陽性血清按體積稀釋到16~32倍，也可以被其檢測到；運用該 試紙條檢測非免疫鴨陰性血清、鴨瘟病毒陽性血清、鴨疫里默氏菌陽性血清、鴨沙門氏菌陽 性血清、鴨甲型肝炎病毒陽性血清及鴨大腸桿菌陽性血清，結(jié)果顯示只有鴨甲型肝炎病毒 陽性血清可見兩條清晰可見的兩條紅色條帶，呈陽性結(jié)果，而其他血清只在C線處可見一 條紅色條帶，呈陰性結(jié)果，表明本發(fā)明所述試紙條具有很好的特異性；應(yīng)用本發(fā)明所述試紙 條檢測I型鴨甲肝病毒抗體具有良好的批內(nèi)和批間重復(fù)性；本發(fā)明制備的試紙條可在4°C 或室溫（25 °C)保存數(shù)月。
【附圖說明】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0020] 圖1密碼子優(yōu)化結(jié)果，其中，紅色氨基酸進行了密碼子優(yōu)化。
[0021] 圖2為重組表達載體pET28a(+)-〇ptiVPl的雙酶切鑒定結(jié)果；其中，1泳 道為重組質(zhì)粒pET28a (+) -optiVPl用EcoRI單酶切得到的產(chǎn)物；2泳道為重組質(zhì)粒 pET28a (+)-optiVPl用EcoRI和Xhol雙酶切得到的兩個片段（所示小片段的分子量大小約 為714bp) ;3泳道為DL15000相對分子質(zhì)量標準。
[0022] 圖3為重組表達蛋白的SDS-PAGE鑒定結(jié)果；其中，圖中1泳道為表達的optiVPl 蛋白（箭頭所示蛋白質(zhì)分子量大小約為32KD) ;2泳道為pET28a(+)空載體表達產(chǎn)物；3泳 道為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準。
[0023] 圖4為optiVPl重組蛋白可溶性分析，M泳道為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1泳道 為包涵體，2泳道為上清，3泳道為pET28a (+)空載體表達產(chǎn)物。
[0024] 圖5為不同IPTG濃度誘導(dǎo)pET28a(+)-〇ptiVPl表達結(jié)果；M泳道為蛋白質(zhì)相對分 子質(zhì)量標準，1~7泳道依次為IPTG濃度0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0和1. 2mmol/L時載體表 達產(chǎn)物，8泳道為pET28a(+)空載體表達產(chǎn)物。
[0025] 圖6為不同溫度誘導(dǎo)pET28a(+)-〇ptiVPl表達結(jié)果；1泳道為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì) 量標準，2~4泳道依次為溫度16、25和37°C時載體表達產(chǎn)物，5泳道為pET28a(+)空載體 表達的產(chǎn)物。
[0026] 圖7為不同時間誘導(dǎo)pET28a(+)-〇ptiVPl表達結(jié)果；M泳道為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì) 量標準，1~7泳道依次為誘導(dǎo)時間0、2、4、6、8、10和1211載體表達產(chǎn)物，8泳道為口￡128 &(+) 空載體表達的產(chǎn)物。
[0027] 圖8為optiVPl重組蛋白的純化結(jié)果；1泳道為未純化的蛋白，2泳道為純化的 optiVPl蛋白，3泳道為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準。
[0028] 圖9為optiVPl重組蛋白免疫原性檢測結(jié)果；1泳道為以兔抗DHAV-1作為一抗檢 測optiVPl重組蛋白（約為32KD)，2泳道為預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準，3泳道為陰性對 照pET28a(+)空載體。
[0029] 圖10為膠體金免疫層析試紙條的組裝示意圖。
[0030] 圖11為膠體金免疫層析試紙條的判定結(jié)果。
[0031] 圖12為試紙條上各物質(zhì)工作濃度優(yōu)化結(jié)果，其中，A圖為優(yōu)化NC膜T線上optiVPl 重組蛋白包被濃度；B圖為優(yōu)化NC膜C線上兔IgG包被濃度；C圖為優(yōu)化金標optiVPl重組 蛋白和金標羊抗兔IgG工作濃度。
[0032] 圖13為膠體金免疫層析試紙條特異性試驗結(jié)果。
[0033]圖14為膠體金免疫層析試紙條敏感性試驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0034] 下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
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