一種抗除草劑草甘膦基因表達(dá)結(jié)構(gòu)及其在玉米中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬農(nóng)作物的生物工程育種領(lǐng)域，具體說(shuō)，涉及一種抗除草劑草甘膦基因表 達(dá)結(jié)構(gòu)及其在玉米中的應(yīng)用，是通過(guò)人工合成除草劑草甘膦抗性基因、定向重組到玉米基 因高效表達(dá)的插盒中，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得耐草甘膦特性?xún)?yōu)異的轉(zhuǎn)基因玉米。
【背景技術(shù)】
[0002] 草害是影響作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要因素。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FA0)統(tǒng)計(jì)，全世界 每年因病蟲(chóng)草害致農(nóng)作物產(chǎn)量下降三分之一，其中因草害損失11%。要滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的需 求，糧食生產(chǎn)的集約化和提高單位面積上的生產(chǎn)力是首選措施，而這需要加強(qiáng)草害的防治。 針對(duì)草害，傳統(tǒng)防治措施主要是依靠中耕除草和除草劑施用，成本較高。
[0003] 玉米是重要的糧食和飼料作物，也是重要的工業(yè)原料和能源作物，在我國(guó)經(jīng)濟(jì)中 起著十分重要的作用。我國(guó)玉米種植區(qū)域廣，雜草種類(lèi)及危害情況也極為復(fù)雜，并且因耕作 制度和除草方式使雜草群落不斷演替而危害玉米生長(zhǎng)。雜草與玉米相伴而生，地上爭(zhēng)奪陽(yáng) 光和空間，妨礙田間通風(fēng)透光，造成玉米群體光能利用率低；地下則爭(zhēng)奪土壤養(yǎng)分、水分，導(dǎo) 致玉米植株?duì)I養(yǎng)不良，嚴(yán)重影響了玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。同時(shí)，許多雜草是農(nóng)作物病蟲(chóng)的天然 寄主，易導(dǎo)致病蟲(chóng)害在玉米田間傳播。
[0004] 自從1942年除草劑2, 4-D問(wèn)世以來(lái)，雜草防治由人工除草進(jìn)入化學(xué)除草時(shí)代。此 后，除草劑新品種層出不窮，應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣，有效的提高了勞動(dòng)生產(chǎn)率、降低了成本。 1971年草甘磷上市，該除草劑為內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生性除草劑，除草效果好，且在環(huán)境中容 易降解。草甘膦能競(jìng)爭(zhēng)性抑制莽草酸途徑中5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS) 的活性，從而阻斷芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，擾亂生物體正常的氮代謝 而使其死亡。其在24-28小時(shí)內(nèi)就可擴(kuò)散到整棵植株，使其2-10天內(nèi)出現(xiàn)枯萎或死亡。由 于草甘膦是一種非選擇性除草劑，對(duì)農(nóng)作物同樣有毒害作用，噴施后對(duì)作物的光合作用和 代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一定的影響，這極大限制了草甘膦在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，因此，耐除草甘膦 轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展無(wú)疑有廣泛市場(chǎng)。1985年，Comai等從鼠傷寒沙門(mén)氏菌中分離出了抗草 甘膦的突變基因aroA并將其轉(zhuǎn)入煙草，首次獲得了耐除草劑的轉(zhuǎn)基因植物，之后有關(guān)抗草 甘膦新基因研究報(bào)道層出不窮，耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物也相繼研發(fā)成功并推廣應(yīng)用。2011年， 耐除草劑性狀轉(zhuǎn)基因作物種植面積為9390萬(wàn)公頃，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的59%。同 時(shí)也減輕了農(nóng)藥濫用對(duì)農(nóng)業(yè)環(huán)境的影響。
[0005] 耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物得以應(yīng)用的兩個(gè)關(guān)鍵因素是：耐草甘膦基因的獲得以及該基 因在轉(zhuǎn)基因作物中的表達(dá)量能保證草甘膦在除草劑量施用下植株仍能生長(zhǎng)發(fā)育正常。也就 是說(shuō)，高抗草甘膦基因的發(fā)掘及利用是轉(zhuǎn)基因作物成功推廣的奠基石。目前，在轉(zhuǎn)基因耐除 草劑植物中草甘膦抗性基因即突變的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS)基因 最為廣泛應(yīng)用。
[0006] 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS)催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)和 3-磷酸莽草酸（S3P)合成5'-烯醇式丙酮酸-3'-磷酸莽草酸?？煞譃閮深?lèi)（Ming He 等，2001)。以鼠傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌為代表的這一類(lèi)具有相同氨基酸保守序列的EPSPS 合酶被稱(chēng)做Class I EPSPS。以農(nóng)桿菌CP4、假單胞菌PG2982為代表的稱(chēng)為Class II EPSPS。兩類(lèi)EPSPS擁有各自的結(jié)構(gòu)特征，且氨基酸序列相似性低于50%。從這些物種中克 隆出的EPSPS基因也相應(yīng)分成了兩類(lèi)。一些大型國(guó)際生物技術(shù)公司已明確了 epsps基因中 對(duì)草甘膦抗性有影響的氨基酸保守序列，并申請(qǐng)了相關(guān)專(zhuān)利，構(gòu)筑了嚴(yán)密的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù) 網(wǎng)。就草甘膦抗性來(lái)講，Class II EPSPS成員突變體對(duì)草甘膦表現(xiàn)出的抗性普遍較高。如 大面積推廣的抗草甘膦玉米所含的抗性基因就是從根癌農(nóng)桿菌CP4中克隆出的CP4-ep Sps 基因（Class II)。我國(guó)在草甘膦抗性菌株和基因資源的研究方面也取得重要進(jìn)展。朱玉 和劉柱等分別從草甘膦極端污染的環(huán)境中分離到了兩株抗性極強(qiáng)的菌株-熒光假單胞菌 G2(psedomonas fluorescens G2)和可變鹽單胞菌HTG7(Halomonas Variabilis HTG7)，并 克隆出2個(gè)結(jié)構(gòu)新穎、功能明確的草甘膦抗性新基因。它們均不含專(zhuān)利保護(hù)的氨基酸序列 及突變位點(diǎn)，與之前已報(bào)道的Class I和Class II家族中的草甘膦抗性基因相似性低，顯 示了有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。該基因也被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆、棉花和油菜等多種植物。 Heck等（2005)構(gòu)建了一個(gè)分別用水稻actin 1啟動(dòng)子和花椰菜花葉病毒P35s啟動(dòng)子啟動(dòng) CP4-印sps基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因玉米在高于生產(chǎn)應(yīng)用濃度2~4倍劑量的除草劑噴施 條件下均有植株正常生長(zhǎng)，獲得了高抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因株系，并完成了商品化。Howe (2002) 等將突變后的玉米印sps基因和G0X基因一同轉(zhuǎn)入玉米細(xì)胞，產(chǎn)生的愈傷組織經(jīng)過(guò)ImM和 3mM草甘膦各篩選一個(gè)月后，再生出玉米轉(zhuǎn)化植株；在植株約61cm高時(shí)噴施0. 036升/公 頃的除草劑農(nóng)達(dá)（40%草甘膦）篩選抗性植株，獲得了抗性品種，并完成了商品化。我國(guó) 對(duì)耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的研究也取得很大進(jìn)步。具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的G2-ep Sps基因 被轉(zhuǎn)入煙草和棉花后，獲得可耐受草甘膦的能力（劉錫娟等，2007)。2008年，赫福霞等， 對(duì)G2-印sps進(jìn)行植物密碼子優(yōu)化后轉(zhuǎn)入玉米，獲得了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米，并建立了以 2mG2-印sps基因（優(yōu)化后基因）為篩選標(biāo)記的玉米轉(zhuǎn)化體系。在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，愈傷組織篩 選壓力為ImM的草甘膦異丙胺鹽篩選15天。2010年余桂容等將2mG2-ep SpS基因轉(zhuǎn)入10 個(gè)優(yōu)良玉米自交系，并確定了不同自交系草甘膦的最適篩選濃度（變幅在1%。-1. 25%。）， 但未達(dá)到生產(chǎn)上應(yīng)用濃度2%。，在隨后發(fā)表的文章中又將2mG2-印sps和R79-印sps (從宏 基因組文庫(kù)中分離的R79菌株中克?。?gòu)建到同一表達(dá)載體中轉(zhuǎn)入玉米，獲得最高可耐受 6%。的草甘膦濃度的轉(zhuǎn)基因玉米。劉柱等（2004)從草甘膦的耐受濃度高達(dá)900mM可變鹽單 胞菌中克隆出新的epsps基因，提示該基因有很好的應(yīng)用前景。
[0007] 除草劑抗性基因能否在受體植物中高效表達(dá)產(chǎn)生理想的抗性性狀，不僅取決于基 因的來(lái)源及堿基序列的特異性、轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)，而且決定于轉(zhuǎn)基因表達(dá)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)基因表 達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)基因表達(dá)結(jié)構(gòu)一般是由"啟動(dòng)子-基因編碼區(qū)-轉(zhuǎn)錄終止區(qū)"組成，在 單子葉植物中，高效表達(dá)的啟動(dòng)子一般與基因的內(nèi)含子序列緊鄰，內(nèi)含子可明顯提高基因 表達(dá)豐度，植物基因工程常用的啟動(dòng)子Pubiqintin、Pactin均含有內(nèi)含子序列。轉(zhuǎn)錄終止 區(qū)不僅保證了編碼區(qū)的正確轉(zhuǎn)錄，而且對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性即半衰期有很大影響。構(gòu)建理 想的轉(zhuǎn)基因表達(dá)結(jié)構(gòu)可使轉(zhuǎn)基因高效轉(zhuǎn)錄，且產(chǎn)物穩(wěn)定。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性還取決于基 因編碼區(qū)的堿基組成，不同進(jìn)化階梯上的生物，其基因的堿基組成可有明顯不同，異源的堿 基組成差異較大的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物往往會(huì)表現(xiàn)出不穩(wěn)定現(xiàn)象，即易被降解，半衰期短。另外，物種 對(duì)密碼子具有不同程度的偏好性，即一些密碼子在特定的物種中使用頻率高，而另一些密 碼子在特定物種中使用頻率低，這種特性會(huì)影響特定蛋白的合成速率。因此，要實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因 在受體植物中高效表達(dá)并產(chǎn)生理想性狀，需要基因編碼區(qū)的堿基序列適合于該基因的高效 表達(dá)，即用受體物種偏愛(ài)的密碼子取代在受體物種中利用率低的密碼子、改變影響mRNA壽 命的DNA片段；需要將基因編碼區(qū)與高效表達(dá)的啟動(dòng)子融合；需要在基因的3'區(qū)連上能提 高mRNA壽命的3'尾巴區(qū)。轉(zhuǎn)基因的插入位點(diǎn)也明顯影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)強(qiáng)度，因此，也需要 獲得大量的轉(zhuǎn)化事件，從中選擇合乎目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)目前的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種抗除草劑草甘膦基因表達(dá)結(jié)構(gòu)及 其在玉米中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所述的抗除草劑草甘膦基因表達(dá)結(jié)構(gòu)，其特征在于：所述基因表達(dá)結(jié)構(gòu)由 玉米Ubiqitinl基因啟動(dòng)子-人工合成的草甘膦耐性基因mEPSPS-水稻GluB5基因終止區(qū) TgluB5核苷酸片段構(gòu)成；其中，所述草甘膦耐性基因mEPSPS的核苷酸序列如SEQID No. 1 所示，所述水稻GluB5基因終止區(qū)TgluB5核苷酸片段的序列如SEQID No. 3所示，所述玉 米Ubiqitinl基因啟動(dòng)子的核苷酸序列