一種基于rmce技術(shù)的轉(zhuǎn)基因方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因修飾技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于RMCE技術(shù)的轉(zhuǎn)基因方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，多采用顯微注射，其具有試驗周期短、目的基因片段長度可達(dá) 100kb、整合效率高等優(yōu)點(diǎn)，但還是存在諸多不足和缺點(diǎn)，如外源基因是以隨機(jī)插入的方式 進(jìn)入受體基因組，其整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)都無法精確掌握，有可能引起基因沉默，更改細(xì)胞或 組織特異性基因的表達(dá)水平，甚至影響整個基因組的表達(dá)情況，從而造成宿主優(yōu)良性狀的 丟失，甚至有致死性狀的出現(xiàn)。
[0003] 重組酶介導(dǎo)的盒式交換技術(shù)（Recombinase Mediated Massette Exchange，RMCE) 與同類方法相比，具有定點(diǎn)、高效、簡單而又可能對基因組進(jìn)行反復(fù)修飾等特點(diǎn)，因而在研 究基因功能、分析順式作用成分以及構(gòu)建各種轉(zhuǎn)基因動物、建立人類疾病動物模型等方面 具有很大的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：為了克服上述轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，研制基于RMCE技術(shù)的轉(zhuǎn)基因 技術(shù)，為科學(xué)研究和市場應(yīng)用提供前期基礎(chǔ)，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種基 于RMCE技術(shù)的轉(zhuǎn)基因方法。
[0005] 本發(fā)明解決了現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)插入位置及拷貝數(shù)不確定、引起基因沉默、更改細(xì) 胞或組織特異性基因的表達(dá)水平，甚至?xí)绊懻麄€基因組的表達(dá)情況。本發(fā)明可在短時間 內(nèi)、高效率、精確的獲得定點(diǎn)插入的轉(zhuǎn)基因鼠。
[0006] 技術(shù)方案：為了解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種基于RMCE技術(shù)的轉(zhuǎn)基因 方法，包括以下步驟：
[0007] 1)構(gòu)建載體：以Rosa26載體為框架，加上Lox2272位點(diǎn)或Attp70位點(diǎn)、廣譜性啟 動子、焚光蛋白基因、LoxP位點(diǎn)或Attp70位點(diǎn)、Frt位點(diǎn)、篩選標(biāo)記和DTA終止區(qū)域；
[0008] 2)載體測序正確后，電轉(zhuǎn)到ES細(xì)胞中，用含有抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得陽 性ES細(xì)胞；
[0009] 3) PCR 或 Southern Blot 再次驗證；
[0010] 4)將帶有Flp重組酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到陽性ES細(xì)胞中，獲得沒有篩選標(biāo)記的陽性ES細(xì) 胞；
[0011] 5)將驗證正確的陽性ES細(xì)胞顯微注射到小鼠的囊胚中，而后轉(zhuǎn)移至代孕母鼠中， 獲得含有熒光標(biāo)記的RMCE工具鼠。
[0012] 其中，上述啟動子為EF1 a、CAG、CMV或其他所有廣譜性表達(dá)的強(qiáng)啟動子。
[0013] 其中，上述熒光蛋白為eGFP、mCherry、RFP、BFP或其他所有發(fā)揮追蹤作用的蛋白。
[0014] 其中，上述篩選標(biāo)記為Neo、Puro或其他所有能達(dá)到篩選目的的蛋白。
[0015] 有益效果：本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 1)操作簡單、周期短，節(jié)省時間和成本；
[0017] 2)只需確定目的基因的序列信息，即可實現(xiàn)基因的定點(diǎn)插入；
[0018] 3)減少隨機(jī)插入引起的非必要的基因沉默；
[0019] 4)避免基因突變造成的胚胎過早死亡等。
[0020] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，是由RMCE與重組酶技術(shù)融合而來，其既有RMCE技術(shù)的優(yōu) 點(diǎn)，又能實現(xiàn)基因的定點(diǎn)插入，轉(zhuǎn)基因效率高、同時也減少了基因的隨機(jī)插入帶來的毒性。
[0021] 本發(fā)明只需要設(shè)計簡單的載體，即可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠的構(gòu)建；利用此工具鼠可以在 短時間內(nèi)高效、特異性的完成基因的定點(diǎn)插入，為人類疾病的研究提供理論依據(jù)和動物模 型。另外此發(fā)明也可作為臨床和醫(yī)藥研究的配套技術(shù)，為人類健康保駕護(hù)航。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :實施例1中工具鼠構(gòu)建的載體骨架；
[0023] 圖2 :實施例2中工具鼠構(gòu)建的載體骨架；
[0024] 圖3:PCR擴(kuò)增獲得720bp的eGFP片段和1179bp的EF1a片段瓊脂糖凝膠電泳 圖；
[0025] 圖4 :EF1 a菌落PCR結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0026] 圖5 :eGFP菌落PCR結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0027] 圖6 :5' arm PCR鑒定結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0028] 圖7 :3' arm PCR鑒定結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0029] 圖8 :焚光顯微鏡檢測ES細(xì)胞圖片；
[0030] 圖9 :PCR擴(kuò)增獲得1507bp的目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0031 ] 圖10 :菌落PCR擴(kuò)增獲得748bp的片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0032] 圖11 :PCR驗證擴(kuò)增獲得659bp的片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0033] 圖12 :PCR擴(kuò)增獲得672bp CMV片段、720bp的eGFP片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0034] 圖13 :CMV菌落PCR獲得513bp的擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0035] 圖14 :eGFP菌落PCR獲得615bp的擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0036] 圖15 :5' arm PCR鑒定結(jié)果，獲得3. lkb的擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0037] 圖16 :3' arm PCR鑒定結(jié)果，獲得4. 5kb的擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0038] 圖17 :焚光顯微鏡檢測ES細(xì)胞圖片；
[0039] 圖18 :PCR擴(kuò)增獲得845bp的目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0040] 圖19 :菌落PCR擴(kuò)增獲得421bp的片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0041] 圖20 :PCR驗證擴(kuò)增獲得725bp的片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0042] 圖 21 :加上 Lox2272 位點(diǎn)、EF1 a、eGFP 基因、LoxP 位點(diǎn)、Frt 位點(diǎn)、Neo 和 DTA 終 止區(qū)域的R〇sa26載體骨架；
[0043] 圖22 :EF1 a后連入CHRM4基因的外顯子序列；
[0044] 圖23 :加上Attp70位點(diǎn)、CMV、eGFP基因、AttP70位點(diǎn)、Frt位點(diǎn)、Neo和DTA終止 區(qū)域的Rosa26載體骨架；
[0045] 圖24 :CMV啟動子之后連入hNQOl的外顯子序列；
[0046] 圖25 :常規(guī)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建。
【具體實施方式】
[0047] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。
[0048] 1、實驗材料
[0049] 實施例1 :
[0050] 插入基因簡介：人類的 Cholinergic Receptor，Muscarinic 4 (CHRM4)基因， Ensembl的基因編號為ENSG00000180720,基因編碼區(qū)全長1437bp ;其功能多樣，如參與抑 制腺苷酸環(huán)化酶、磷酸肌醇的降解等。本實施例的EF1 a、eGFP基因、CHRM4基因等所有的 DNA模板由蘇州金唯智基因公司合成的。
[0051] ( -）工具鼠的構(gòu)建
[0052] 1、載體構(gòu)建：在Rosa26載體骨架上連入加上Lox2272位點(diǎn)、EF1 a、eGFP基因、 LoxP位點(diǎn)、Frt位點(diǎn)、Neo和DTA終止區(qū)域。載體骨架如圖21。
[0053] 1)片段的PCR擴(kuò)增：
[0054] 引入EF1 a、Lox2272位點(diǎn)的引物：
[0055] mRosa26-EFla_F/Hpa]
GGCTCCGGTGCCCGTCAGT
[0056] mRosa26_EF 1a- R/ AsisI:
TCACGACACCTGAAATGGAAG
[0057] 備注：加粗部分為同源臂、灰色部分為Lox2272位點(diǎn)序列
[0058] 引入eGFP基因、LoxP位點(diǎn)的引物：
TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC
[0061] 備注：加粗部分為同源臂、灰色部分為LoxP位點(diǎn)序列
[0062] EFla或者eGFP基因的PCR擴(kuò)增體系：
[0063]
[0064] EFla或者eGFP基因的PCR擴(kuò)增程序：
[0065]
[0066] PCR擴(kuò)增結(jié)果參見圖3, PCR擴(kuò)增獲得720bp的eGFP片段、1179bp的EF1 a片段。
[0067] 2)將獲得的片段連接、轉(zhuǎn)化、涂板、挑單克隆，進(jìn)行菌落PCR驗證：
[0068] 菌落PCR的模板是來源于上述挑選的單菌落。挑選的單菌落混于10 y L的滅菌的 蒸餾水中后，取1. 5 yL作為模板。
[0069] EFla的菌檢引物：
[0070] mRosa26-EFla -SF:CCAGCCTGGTCTACACATCAAG
[0071] mRosa26-EFla -SR:ACCACACACGGCACTTACCTG
[0072] eGFP的菌檢引物：
[0073] mRosa26-eGFP-SF:CCACAACATCGAGGACGGCAG
[0074] Neo_R:CTAAAGCGCATGCTCCAGACTG
[0075] 菌落PCR體系：
[0076]
[0077] 菌落PCR程序：
[0078]
[0079] 菌落PCR結(jié)果：EF1 a菌落PCR結(jié)果參見圖4,獲得515bp的擴(kuò)增片段，eGFP菌落 PCR結(jié)果參見圖5,獲得700bp的擴(kuò)增片段。
[0080] 3)將驗證正確的克隆子送交測序
[0081] 2、將測序正確的載體電轉(zhuǎn)至ES細(xì)胞中，用含有新霉素的培養(yǎng)基篩選，獲得陽性ES 細(xì)胞；
[0082] 3、PCR再次驗證；
[0083] 1)5'armPCR鑒定引物：
[0084] Utexas001_KI_Rl：CTTGGCCCGCATTTACAAGACTATC
[0085] Utexas001_5PCR_Fl：TCTCGTCGCTGATTGGCTTCTTT
[0086] PCR擴(kuò)增體系：
[0087]
[0088] 上述的DNA模板的獲取：陽性的ES細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解后就直接使用作為模 板；陽性的ES細(xì)胞加入lmL細(xì)胞裂解液，56°C，過夜即可；細(xì)胞裂解液的成分如下：50mmol/ L的Tris，PH8.0 ;100mmol/L的EDTA;mmol/L的NaCl;1%SDS;100yL的蛋白酶K(100mg/ mL) 〇
[0089] PCR程序：
[0090]
[0091] 鑒定結(jié)果參見圖6, 5'armPCR鑒定結(jié)果，獲得3. 7kb的擴(kuò)增片段。
[0092] 2)3'armPCR鑒定引物
[0093] NeoPCRF161 ? 3:GCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTA
[0094] UtexasOO1_3PCR_R2：AAGACACCAGTTTCAGCCCAAGTTC
[0095] PCR擴(kuò)增體系
[0096]
[0097]
[0098] DNA的獲?。宏栃缘腅S細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解后就直接使用作為模板；陽性的ES 細(xì)胞加入lmL細(xì)胞裂解液，56°C，過夜即可；細(xì)胞裂解液的成分如下：
[0099] 50mmol/L 的 Tris，PH 8. 0 ;100mmol/L 的 EDTA ;mmol/L 的 NaCl ;1 % SDS ;100 y L 的蛋白酶K(100mg/mL)。
[0100] PCR 程序：
[0101]
[0102] 鑒定結(jié)果參見圖7, 3' arm PCR鑒定結(jié)果，獲得4. 8kb的擴(kuò)增片段。
[0103] 4、將帶有Flp重組酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到陽性ES細(xì)胞中，獲得沒有篩選標(biāo)記的陽性ES細(xì) 胞，熒光顯微鏡檢測，ES細(xì)胞中具有綠色熒光，如圖8。
[0104] 5、將陽性ES細(xì)胞顯微注射到小鼠囊胚中，而后轉(zhuǎn)移至代孕母鼠中，獲得含有eGFP 的RMCE工具鼠。
[0105] (二）轉(zhuǎn)基因小鼠的制作
[0106] 1、插入載體的構(gòu)建：在EFla后連入CHRM4基因的外顯子序列，如圖22。
[0107] CHRM4基因的PCR擴(kuò)增引物：
[0108] CK070-KI-F:CTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGCCACCATGGCCAACTTCACACCTGTC
[0109] CK070-KI-R:TCTAGTCCGCGGGTGCGATCGCGGTGGCGACCGGTGGATCCCGCC
[0110] PCR擴(kuò)增體系：
[0111]
[0112]
[0113] PCR擴(kuò)增程序：
[0114]
[0115] PCR擴(kuò)增結(jié)果參見圖9 :PCR擴(kuò)增獲得1507bp的目的基因片段。
[0116] 2、將獲得的片段連接、轉(zhuǎn)化、涂板、挑單克隆，進(jìn)行菌落PCR驗證。
[0117] 菌落PCR的模板是來源于上述挑選的單菌落。挑選的單菌落混于10 yL的滅菌的 蒸餾水中后，取1. 5 yL作為模板。
[0118] 目的片段菌檢引物：
[0119] KI070-KI-Scr-F:CCGTAATGCAGAAGAAGACCATG
[0120] pBas i c_Scr-R:CTAAAGCGCATGCTCCAGACTG
[0121] PCR擴(kuò)增體系：
[0122]
[0123] PCR擴(kuò)增程序：
[0124]
[0125] PCR擴(kuò)增結(jié)果參見圖10 :菌