一種檢測(cè)b群鏈球菌感染的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干化學(xué)酶快檢技術(shù)，尤其是涉及一種采用干化學(xué)酶快檢技術(shù)檢測(cè)B群鏈球菌感染的方法，本發(fā)明還涉及檢測(cè)B群鏈球菌感染用試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]B群鏈球菌(group B streptococcus, GBS)，又稱(chēng)B族鏈球菌或無(wú)乳鏈球菌(S.agalactiae)，兼性厭氧，革蘭氏陽(yáng)性球菌，在顯微鏡下呈單個(gè)、成雙或鏈狀排列，長(zhǎng)短不一；在血瓊脂平板上36± 1°C培養(yǎng)18~24 h，形成灰白色、表面光滑、有乳光、圓形、β溶血的菌落，也有少數(shù)菌株無(wú)β溶血環(huán)；觸酶試驗(yàn)陰性、馬尿酸鈉試驗(yàn)陽(yáng)性、CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性。
[0003]B群鏈球菌正常寄居于人類(lèi)陰道和直腸，是一種條件致病菌，大約1/3的成人腸道和1/4的婦女陰道存在B群鏈球菌，新生兒可直接自母體或分娩時(shí)由母體生殖道寄殖菌上行感染。成人中B群鏈球菌感染少見(jiàn)，以產(chǎn)婦為主，少數(shù)情況下亦可為免疫功能低下者，如糖尿病、慢性肝功能不全、HIV感染、惡性腫瘤接受免疫抑制劑治療等病人也可感染B組鏈球菌病。根據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(⑶C)統(tǒng)計(jì)，約10%~30%的孕婦感染GBS，有40%~70%在生產(chǎn)過(guò)程感染新生兒，其中1°/『3%出現(xiàn)早期侵入性感染，造成呼吸道的癥狀，引起新生兒肺炎、腦膜炎，甚至敗血癥等癥狀，更嚴(yán)重的可能造成死亡，近年來(lái)死亡率達(dá)4°/『6%。1996年美國(guó)疾病預(yù)防控制中心發(fā)布《圍產(chǎn)期B族鏈球菌感染及預(yù)防指南》，并于2002年、2010年兩次修訂，明確提出:對(duì)所有孕婦于妊娠35~37周進(jìn)行B群鏈球菌篩查，結(jié)果陽(yáng)性者進(jìn)行預(yù)防性治療。
[0004]目前B群鏈球菌篩查方法有四種:1、標(biāo)本經(jīng)血瓊脂平板培養(yǎng)分離后，可疑菌落進(jìn)行觸酶試驗(yàn)、馬尿酸鈉試驗(yàn)及CAMP試驗(yàn)等驗(yàn)證確認(rèn)；2、標(biāo)本經(jīng)血瓊脂平板培養(yǎng)分離，革蘭氏染色陽(yáng)性的可疑菌落用細(xì)菌鑒定儀直接鑒定；3、標(biāo)本經(jīng)血瓊脂平板培養(yǎng)分離后，可疑菌落直接用MALD1-T0F質(zhì)譜儀鑒定；4、標(biāo)本經(jīng)B群鏈球菌顯色瓊脂平板培養(yǎng)后直接鑒別。其中方法I所需時(shí)間最長(zhǎng)，一般要2-3天，并且手工操作復(fù)雜，經(jīng)驗(yàn)要求較高，工作量大；方法2所需時(shí)間也較長(zhǎng)，一般1-2天，經(jīng)驗(yàn)要求較高，特別是一旦染色誤判，直接影響后面的上機(jī)鑒定結(jié)果，另外還需要較昂貴的儀器(細(xì)菌鑒定儀)；方法3所需時(shí)間較短一些，需要一天多一些，另需要極昂貴的儀器(MALD1-T0F質(zhì)譜儀)；方法4操作簡(jiǎn)單，只需要根據(jù)培養(yǎng)后菌落的顏色直接鑒別B群鏈球菌即可，但由于也需要培養(yǎng)，因此所需時(shí)間也要I天。上述四種方法的共同點(diǎn)就是都需要進(jìn)行標(biāo)本的劃線分離培養(yǎng)，而這一工作在醫(yī)院臨床科室人員中是沒(méi)有能力進(jìn)行的，直接影響了 B群鏈球菌臨床篩查工作的開(kāi)展。
[0005]由于很多細(xì)菌都具有特異性的酶，根據(jù)相關(guān)酶反應(yīng)的有無(wú)或強(qiáng)弱可以鑒別相關(guān)微生物，這一技術(shù)已廣泛用于微生物的鑒別，具體的應(yīng)用技術(shù)又有細(xì)菌顯色培養(yǎng)基技術(shù)、用于細(xì)菌生化鑒別的鑒定技術(shù)以及快速檢測(cè)微生物的干化學(xué)酶快檢技術(shù)。雖然利用酶反應(yīng)的高靈敏、高特異以及反應(yīng)快等特點(diǎn)結(jié)合固相載體的局部富集技術(shù)產(chǎn)生的干化學(xué)酶快檢技術(shù)，以其操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)近些年來(lái)得到了廣泛的應(yīng)用，但截止目前，尚未見(jiàn)到運(yùn)用此技術(shù)檢測(cè)B群鏈球菌的文獻(xiàn)及產(chǎn)品，也未發(fā)現(xiàn)在馬尿酸鈉試驗(yàn)特別是快速馬尿酸鈉試驗(yàn)中，使用顯色底物替代馬尿酸鈉進(jìn)行試驗(yàn)的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，在短時(shí)間內(nèi)即能得到鑒定結(jié)果的檢測(cè)B群鏈球菌感染的方法，本發(fā)明還提供檢測(cè)B群鏈球菌感染用試劑盒。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案:
本發(fā)明所述的檢測(cè)B群鏈球菌感染的方法為:采用馬尿酸或馬尿酸鹽類(lèi)似物作為顯色底物與緩沖液配制的檢測(cè)試劑，通過(guò)B群鏈球菌中具有的馬尿酸酶能夠特異性識(shí)別顯色底物中甘氨酸與苯甲酸的結(jié)合，并水解鏈接二者的酰胺鍵，使顯色底物顏色改變，以此來(lái)判斷檢測(cè)樣本中是否感染B群鏈球菌。
[0008]所述馬尿酸或馬尿酸鹽類(lèi)似物是一端為甘氨酸或甘氨酸鹽通過(guò)酰胺鍵與另一端苯甲酸類(lèi)似物的苯甲酸羧基相鏈接的一類(lèi)化合物。如可以是3，3-二(4-羥基-5-異丙基-2-甲苯基)-3-羥基-苯甲酰甘氨酸或它的鹽，也可以是2-[ [4-( 二甲基氨基)苯基]偶氮]-苯甲酰甘氨酸或它的鹽等等。
[0009]所述緩沖液為濃度0.025M-0.2M、pH 3.8-5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或醋酸-醋酸鈉緩沖液。
[0010]本發(fā)明所述的檢測(cè)B群鏈球菌感染用試劑盒，包括固化有馬尿酸酶檢測(cè)試劑的檢測(cè)試紙，所述馬尿酸酶檢測(cè)試劑由顯色底物馬尿酸或馬尿酸鹽類(lèi)似物與緩沖液配制而成，所述馬尿酸或馬尿酸鹽類(lèi)似物是一端為甘氨酸或甘氨酸鹽通過(guò)酰胺鍵與另一端苯甲酸類(lèi)似物的苯甲酸羧基相鏈接的一類(lèi)化合物，所述緩沖液為濃度0.025M-0.2M、pH 3.8-5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或醋酸-醋酸鈉緩沖液。
[0011 ] 試劑盒中還包括與所述緩沖液組分相同的標(biāo)本稀釋液。
[0012]由于B群鏈球菌具有馬尿酸酶，能夠特異性識(shí)別甘氨酸與苯甲酸的結(jié)合，并水解鏈接二者的酰胺鍵，故顯色底物被B群鏈球菌的馬尿酸酶水解后可呈現(xiàn)出與顯色底物不同的顏色，即發(fā)生顏色變化，根據(jù)顏色變化，即可判斷標(biāo)本中有無(wú)B群鏈球菌的存在。
[0013]本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，無(wú)需細(xì)菌劃線分離技術(shù)所需要的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，僅僅通過(guò)簡(jiǎn)單加樣和短時(shí)(10~30分鐘)孵育即能得到鑒定結(jié)果，檢測(cè)時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于培養(yǎng)基培養(yǎng)所需要的至少24小時(shí)的時(shí)間；且目測(cè)鑒定結(jié)果直觀準(zhǔn)確；本發(fā)明試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，方便操作，性能良好，統(tǒng)計(jì)顯示，采用該試劑盒檢測(cè)，陽(yáng)性預(yù)期值達(dá)85%以上，陰性預(yù)期值達(dá)97%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更加詳細(xì)的說(shuō)明。
[0015]實(shí)施例1
1、制備檢測(cè)試劑紙片
配制10mM檸檬酸-檸檬酸鈉作為緩沖液和樣品稀釋液(PH4.0，內(nèi)含I % [v/v]Triton X-100);將3，3-二(4-羥基-5-異丙基-2-甲苯基)_3_羥基-苯甲酰甘氨酸鈉用上述配制的10mM檸檬酸-檸檬酸鈉溶解，使3，3-二(4-羥