一種桐花魚的分子鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物檢測領域，涉及一種桐花魚的分子鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 桐花魚是我國安徽省的名貴特產(chǎn)，為皖南山區(qū)"魚肴四絕"之一，桐花魚口感細嫩、 營養(yǎng)豐富，除了富含蛋白質(zhì)外，還含有大量鈣、磷、鐵等微量元素，受到廣大消費者的喜愛。 隨著人民生活水平的提高，近年來桐花魚的市場需求量激增，價格持續(xù)走高，也激發(fā)了桐花 魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。
[0003] 桐花魚屬于鯉形目鯉科，是典型的溪水魚類，個體較小，全體長一般不超過20厘 米，除雄魚在繁殖季節(jié)短時間內(nèi)具有典型的性狀特征外，僅靠外形特征很難將桐花魚與其 他常見的鯉科淡水魚分開，例如很難與同等體型大小的鯉魚、青魚、草魚、鰱魚、鳙魚分開。
[0004] 桐花魚的鑒定存在下面兩個難點：一方面，由于目前桐花魚養(yǎng)殖實踐中的親魚，多 來自對捕獲桐花魚的收購。因此養(yǎng)殖業(yè)主亟需一種能快速準確、并且盡最大可能不傷害親 魚的鑒定方法，用以區(qū)分桐花魚的真?zhèn)危砸?guī)避產(chǎn)業(yè)鏈中的后繼損失。另一方面，在水產(chǎn)品 市場上也存在一些不法商家用體型較小的其他魚種冒充桐花魚出售的問題，嚴重損害了消 費者的正當權益。
[0005] 到目前為止，尚未見任何桐花魚鑒定技術的報道，這嚴重制約了桐花魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè) 的發(fā)展和相關管理監(jiān)督部門工作的開展。因此，急需一種桐花魚快速、準確的鑒定方法，為 桐花魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展與相關部門監(jiān)管提供技術支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對目前缺乏桐花魚鑒定技術存在的問題，提供了一種操作簡單、成本低 廉、省時準確、最大程度上不損傷魚體的桐花魚的分子鑒定方法。
[0007] 為了達到上述目的，本發(fā)明采取的技術方案如下：
[0008] 桐花魚的分子鑒定方法，包括以下步驟：
[0009] A.魚磷DNA的提?。涸隰~體尾部或腹部取鮮活魚鱗4-6片，置于1. 5毫升滅菌離 心管中，加入30-50微升裂解液，將鱗片浸沒于裂解液中，在65攝氏度靜置2小時，移至95 攝氏度靜置20分鐘，取1-3微升上清用于PCR擴增；
[0010] B. PCR擴增：進行PCR擴增；PCR反應體系包括1-3微升含100納克DNA的DNA模 板，3微升10Xbuffer，2. 4微升脫氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物，1微升反引物，0. 3微 升Taq聚合酶，無菌水補足至30微升；
[0011] C.酶切：取10微升PCR產(chǎn)物，加入2微升10 X buffer，2微升Xbal，用無菌水補足 至20微升，置于37攝氏度3~5小時；Xbal (限制性內(nèi)切酶）為識別TCTAGA堿基序列的 Xbal內(nèi)切酶。
[0012] D.電泳檢測與鑒定：取5微升酶切產(chǎn)物與1微升6X loading buffer混合，在2% 的瓊脂糖凝膠上點樣，120V條件下電泳15分鐘，用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析電泳結(jié)果，根據(jù) 電泳條帶判定該魚是否桐花魚。
[0013] 作為優(yōu)選，步驟A中，步驟A中，裂解液包含10毫摩爾pH為8.2的Tris-HCl，50 毫摩爾KCL，體積百分比是0. 3%的吐溫20,體積百分比是0. 3%的乙基苯基聚乙二醇和體 積百分比是1 %的蛋白酶K。
[0014] 作為優(yōu)選，步驟A中，用尖頭鑷子在魚體尾部或腹部取鮮活魚鱗。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟A中，將鱗片浸沒于裂解液中，在65攝氏度恒溫水浴槽中靜置2小 時，移至95攝氏度恒溫水浴槽靜置20分鐘，取1-3微升上清用于PCR擴增。
[0016]作為優(yōu)選，正向引物序列為5 ' -GAGACCTGTATGAATGGCTAA-3 '，反向引物序列為 5' -ACTCAGATCACGTAGGACTT-3'，擴增產(chǎn)物為 478bp。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟B中，PCR反應程序為95°C變性5分鐘；95°C變性30秒，55°C變性 30秒，72 °C變性45秒，30個循環(huán)；72 °C延伸10分鐘，擴展完成。
[0018] 作為優(yōu)選，步驟C中，置于37攝氏度恒溫水浴槽3~5小時。
[0019] 作為優(yōu)選，步驟D中，若電泳結(jié)果出現(xiàn)大小分別為169bp和308bp的兩條電泳條 帶，貝丨】判定該DNA樣品來自桐花魚。
[0020] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明公開的桐花魚的分子鑒定方法，步 驟包括魚體DNA的提取、PCR擴增、酶切及電泳檢測鑒定，通過上述四個步驟即可準確的鑒 定測試魚是否為桐花魚。本發(fā)明操作簡單，成本低廉，省時準確，對儀器設備要求低。且本方 法取魚鱗進行分子鑒定，最大程度上降低了對魚體尤其是活體親魚的損傷，便于推廣應用， 能滿足桐花魚養(yǎng)殖業(yè)主、政府監(jiān)管部門對桐花魚親魚、上市桐花魚產(chǎn)品的鑒定需求。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實施例中 所涉及的內(nèi)容。
[0022] 實施例1
[0023] 桐花魚的分子鑒定方法，包括以下步驟：
[0024] A.魚磷DNA的提取：在魚體尾部或腹部取鮮活魚鱗4片，置于1. 5毫升滅菌離心 管中，加入30微升裂解液，將鱗片浸沒于裂解液中，在65攝氏度靜置2小時，移至95攝氏 度靜置20分鐘，取1微升上清用于PCR擴增；
[0025] B. PCR擴增：進行PCR擴增；PCR反應體系包括1微升含100納克DNA的DNA模板， 3微升10 Xbuffer，2. 4微升脫氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物，1微升反引物，0. 3微升 Taq聚合酶，無菌水補足至30微升；
[0026] C.酶切：取10微升PCR產(chǎn)物，加入2微升10 X buffer，2微升Xbal，用無菌水補足 至20微升，置于37攝氏度3小時；
[0027] D.電泳檢測與鑒定：取5微升酶切產(chǎn)物與1微升6Xloadingbuffer混合，在2% 的瓊脂糖凝膠上點樣，120V條件下電泳15分鐘，用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析電泳結(jié)果，若電 泳結(jié)果出現(xiàn)大小分別為169bp和308bp的兩條電泳條帶，則判定該DNA樣品來自桐花魚。
[0028] 實施例2
[0029] 桐花魚的分子鑒定方法，包括以下步驟：
[0030] A.魚磷DNA的提?。涸隰~體尾部或腹部取鮮活魚鱗6片，置于1. 5毫升滅菌離心 管中，加入50微升裂解液，將鱗片浸沒于裂解液中，在65攝氏度靜置2小時，移至95攝氏 度靜置20分鐘，取3微升上清用于PCR擴增；
[0031 ] B. PCR擴增：進行PCR擴增；PCR反應體系包括3微升含100納克DNA的DNA模板， 3微升10 Xbuffer，2. 4微升脫氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物，1微升反引物，0. 3微升 Taq聚合酶，無菌水補足至30微升；
[0032] C.酶切：取10微升PCR產(chǎn)物，加入2微升10 X buffer，2微升Xbal，用無菌水補足 至20微升，置于37攝氏度5小時；
[0033] D.電泳檢測與鑒定：取5微升酶切產(chǎn)物與1微升6Xloadingbuffer混合，在2% 的瓊脂糖凝膠上點樣，120V條件下電泳15分鐘，用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析電泳結(jié)果，根據(jù) 電泳條帶判定該魚是否桐花魚。
[0034] 實施例3
[0035] 桐花魚的分子鑒定方法，包括以下步驟：
[0036] A.魚磷DNA的提?。河眉忸^鑷子在魚體尾部或腹部取鮮活魚鱗5片，置于1. 5毫 升滅菌離心管中，加入35微升裂解液，將鱗片浸沒于裂解液中，在65攝氏度恒溫水浴槽中 靜置2小時，移至95攝氏度恒溫水浴槽靜置20分鐘，取1-3微升上清用于PCR擴增；
[0037] B. PCR擴增：進行PCR擴增；PCR反應體系包括2微升含100納克DNA的DNA模板， 3微升10 Xbuffer，2. 4微升脫氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物，1微升反引物，0. 3微升 Taq聚合酶，無菌水補足至30微升；
[0038] C.酶切：取10微升PCR產(chǎn)物，加入2微升10 X buffer，2微升Xbal，用無菌水補足 至20微升，置于37攝氏度4小時；
[0039] D.電泳檢測與鑒定：取5微升酶切產(chǎn)物與1微升6Xloadingbuffer混合，在2% 的瓊脂糖凝膠上點樣，120V條件下電泳15分鐘，用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析電泳結(jié)果，若電 泳結(jié)果出現(xiàn)大小分別為169bp和308bp的兩條電泳條帶，則判定該DNA樣品來自桐花魚。
[0040] 其中，步驟A中，裂解液包含10毫摩爾pH為8. 2的Tris-HCl，50毫摩爾KCL，體積 百分比是0. 3 %的吐溫20，體積百分比是0. 3 %的乙基苯基聚乙二醇和體積百分比是1 %的 蛋白酶K。
[0041] 實施例4
[0042] 桐花魚的分子鑒定方法，包括以下步驟：
[0043] A.魚磷DNA的提?。涸隰~體尾部或腹部取鮮活魚鱗5片，置于1. 5毫升滅菌離心 管中，加入32微升裂解液，將鱗片浸沒于裂解液中，在65攝氏度靜置2小時，移至95攝氏 度靜置20分鐘，取1. 5微升上清用于PCR擴增；
[0044] B. PCR擴增：進行PCR擴增；PC