納米熒光微粒在單聯(lián)或者多聯(lián)核酸擴增檢測中的應用
【專利說明】納米熒光微粒在單聯(lián)或者多聯(lián)核酸擴増檢測中的應用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及納米熒光微粒在單聯(lián)或者多聯(lián)核酸擴增檢測中的應用。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]聚合酶鏈式反應(PCR)是無需使用活生物體而酶促復制DNA的分子生物學技術(shù)。PCR在醫(yī)學和生物研究實驗室中普遍用于多種任務(wù)，例如檢測遺傳疾病、鑒定基因指紋、診斷感染性疾病、克隆基因、親子鑒定和DNA計算。由于其無與倫比的擴增和準確性能力，分子生物學家已將PCR作為核酸檢測的首選方法。通常在PCR反應的終點或平臺期進行DNA檢測，這使得難于定量起始模板。實時PCR或動態(tài)PCR通過隨著反應進程而記錄擴增子濃度而提高了終點PCR分析的性能。擴增子濃度最常通過與被擴增靶標相關(guān)的熒光信號變化來記錄。熒光探針的信號強度直接影響了 PCR檢測結(jié)果的靈敏性和準確性。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種納米熒光微粒用作單聯(lián)或者多聯(lián)核酸擴增檢測試劑盒的用途，該納米熒光微粒粒徑穩(wěn)定、光譜適用于可見發(fā)射光，該納米熒光微粒通過不同的熒光表達，用于標記在探針堿基兩端作為熒光探針標記物，適用于單聯(lián)或者多聯(lián)的核酸擴增檢測試劑盒。
[0007]為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種納米熒光微粒在單聯(lián)或者多聯(lián)核酸擴增檢測中的應用，所述的納米熒光微粒具有包括內(nèi)核與外殼的核殼結(jié)構(gòu)，粒徑為270~290nm，其內(nèi)核為包含有熒光分子的聚合物微粒，外殼具有修飾在所述聚合物微粒外表面上的一種或多種官能團，該所述官能團能夠直接與配體或生物大分子反應形成微粒表面的共價鍵連接，或在激活后與配體或者生物大分子進行共價標記；所述的聚合物微粒為聚甲基丙烯酸甲酯的微?；蚣谆┧峒柞ヅc其它單體共聚形成的共聚物的微?；蛘咚鼈兊幕旌衔?，其中甲基丙烯酸甲酯單元的重量至少占所述納米熒光微?？傊亓康?0%，所述的熒光分子的重量占所占納米熒光微?？傊亓康?.05°/『5%，所述的納米熒光微粒與分子探針結(jié)合構(gòu)成熒光探針，用于單聯(lián)或多聯(lián)核酸擴增檢測。
[0008]在這里，所述的甲基丙烯酸甲酯與其它單體共聚形成的共聚物中，所述的甲基丙烯酸甲酯與所述其它單體的結(jié)構(gòu)單元數(shù)均大于等于50。所述的其它單體為包括但不限于氟乙稀、氯乙稀、溴乙稀、乙稀碘化、苯乙稀以及丙稀酸等。
[0009]所述的官能團可以為選自羧基，乙醇胺基，羥基，胺基，氨基，亞胺基，環(huán)氧基，異氰酸酯基，金屬醇鹽，及聚乙二醇基中的一種。優(yōu)選為羧基，在該情況下，其他單體為甲基丙烯酸。
[0010]所述熒光分子指在適當?shù)募ぐl(fā)波長下可發(fā)射熒光的物質(zhì)。本發(fā)明中，熒光分子優(yōu)選為熒光素及其衍生物、羅丹明、腎上腺素染料、氟硼瑩等。其中，更優(yōu)選采用羅丹明例如羅丹明Red-X和羅丹明6G等作為熒光分子。熒光分子的重量優(yōu)選為所述納米熒光微?？傊亓康?0.2%~5%。
[0011]進一步優(yōu)選地，所述的納米熒光微粒還包含一種或者一種以上的通過所述官能團共價連接而覆蓋在所述納米熒光微粒表面的生物活性物種，該所述的生物活性物種選自抗體、抗原、核酸、配體、受體、人工多肽、蛋白質(zhì)以及多糖中的一種。所述的生物活性物種能夠參與特異性識別和結(jié)合反應，包括特異性結(jié)合、核酸雜交和酶反應。生物活性物種可通過一個具有明顯親水性的間隔區(qū)域來實現(xiàn)共價標記。這種間隔區(qū)域可以是諸如乙烯乙二醇低聚物的小分子間隔區(qū)域，也可以是諸如肽、蛋白質(zhì)、聚乙二醇、和多糖的大分子實體。微粒表面和生物活性種的結(jié)合包括氨基鍵結(jié)合，酯鍵結(jié)合，C-C鍵結(jié)合，C-N鍵結(jié)合和包含電荷相互作用的結(jié)合。生物活性的例子包括:包含在特定的識別和結(jié)合中的分子實體，諸如抗體、抗原、核酸、配體、受體、人工多肽、蛋白質(zhì)等。該生物活性物種一般都可以采用多種眾所周知的技術(shù)中的任何一種附著在在表面具有官能團的聚合物微粒上。例如，可以使用羧基、氨基、醛基、硫醛基、環(huán)氧基和其它活性或者鍵和功能基、以及剩余的自由基和陽離子自由基將生物活性物種共價附著在微粒上，同時也實現(xiàn)了蛋白的耦聯(lián)反應。一個表面官能團可以作為官能共聚單體的一個組合，因為微粒表面可以包含表面濃度相對較高的極性基。此外該發(fā)明制備的微粒也可以直接共價鍵連接蛋白質(zhì)，而不需要進一步的修改，例如用碳化二亞胺激活微粒表面的羧基，而被激活的羧基與抗體的氨基反應形成酰胺鍵。激活和抗體耦聯(lián)可以發(fā)生在諸如磷酸(鹽)緩沖液，或者2- (N-嗎啉)乙烷磺酸的緩沖液中，由此可以形成微粒結(jié)合物。
[0012]進一步優(yōu)選地，所述的納米熒光微粒是通過以下步驟制得的:
1)、以所述的聚合物微粒和含有所述官能團的烯烴單體為原料，通過微乳液聚合法制備得到外表面上具有所述官能團的聚合物微粒；
2)、向步驟I)所得的外表面上具有所述官能團的聚合物微粒中緩慢注入含有所述熒光分子的有機溶劑和水，聚合物微粒發(fā)生溶脹，熒光分子進入聚合物微粒內(nèi)，然后離心，除去上清液，清洗，加水懸浮，即得所述納米熒光微粒，其中所述有機溶劑為丙酮或二氯甲烷。
[0013]根據(jù)本發(fā)明，步驟I)可采用常規(guī)的微乳液聚合法來實現(xiàn)，最后獲得的聚合物微粒為聚合物、用于提供微粒表面官能團的含有官能團的烯烴單體、表面活性劑、水以及有機溶劑的乳液，這些均為本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所熟知。
[0014]本發(fā)明還提供一種單聯(lián)或者多聯(lián)核酸擴增檢測試劑盒，包括熒光探針，該所述熒光探針由上述的納米熒光微粒與分子探針結(jié)合而成。
[0015]由于上述技術(shù)方案的運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點:本發(fā)明所使用的納米熒光微粒采用基于甲基丙烯酸甲酯的聚合物作為封裝基體，其使用壽命長，易于制造，制備穩(wěn)定且具有良好的單分散性，可以很容易地用各種官能團和生物物種對微粒的表面進行改性，每個微粒上都能夠被連接上大量的熒光分子，是非常好的熒光信號放大的載體，應用于核酸檢測中，可以大大提高檢測靈敏度，且納米熒光微粒非常穩(wěn)定，受外界影響小，熒光穩(wěn)定，這為通過熒光進行定量檢測提供了良好的條件，因此，本發(fā)明納米熒光微粒是熒光檢測技術(shù)中高靈敏度分析檢測和定量測試中的理想標記。此外，本發(fā)明納米熒光微?？捎每梢姽夤庠醇ぐl(fā)以及通過簡單的方法獲得，降低檢測分析成本。
[0016]本發(fā)明的納米熒光微粒的制備方法簡單，獲得的納米熒光微粒中，熒光分子均勻地分布在聚合物微粒中，粒徑均勻、穩(wěn)定，用于制備核酸擴增檢測試劑盒，適用于醫(yī)療診斷、生物檢測、環(huán)境檢測和食品安全監(jiān)測以及不同物種的檢測技術(shù)領(lǐng)域中，具有熒光集團穩(wěn)定，擴增效率高，熒光強度大，結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)勢。
[0017]
【附圖說明】
[0018]附圖1、圖2為本發(fā)明實施例2的納米熒光微粒的掃描電鏡示意圖；
附圖3~6為本發(fā)明核酸擴增檢測在四種波長下的檢測波形示意圖；
附圖7為本發(fā)明納米檢測探針用于PCR檢測與常見熒光物的對比檢測波形示意圖。
[0019]
【具體實施方式】
[0020]以下結(jié)合具體實施例對上述方案作進一步說明，應理解，這些實施例是用于說明