一種羊水中胎兒細(xì)胞vhl基因突變檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種周期短、操作簡單的檢測羊水中胎兒細(xì) 胞VHL基因突變的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] VHL基因（M頂編號608537)定位于3p25-26,全長10KD，包含三個外顯子和兩個內(nèi) 含子，可轉(zhuǎn)錄形成兩種mRNA。包含三個外顯子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的mRNA翻譯出p30 (213個氨基酸） 和pl9 (159個氨基酸）蛋白。pl9是VHL基因第二轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（54號密碼子）轉(zhuǎn)錄形成 的異構(gòu)體，與p30功能相似。
[0003] VHL基因突變方式多樣，包括點(diǎn)突變、大片段缺失、小片段缺失或插入、剪切位點(diǎn) 突變等。目前檢測VHL基因突變最常用的方法是PCR直接測序，準(zhǔn)確率為38 %~80%， 這是由于PCR測序檢測技術(shù)只能檢測點(diǎn)突變、小片段缺失或插入、剪切位點(diǎn)突變，不能檢 測VHL基因大片段缺失；對于VHL基因大片段缺失的檢測，可以采用通用引物熒光定量 PCR(UPQFM-PCR)法，目前，這些檢測技術(shù)多用于外周血樣本的檢測，尚沒有對羊水中胎兒細(xì) 胞VHL基因突變的檢測方法，這一方面是由于羊水穿刺獲得的胎兒細(xì)胞數(shù)量相對于外周血 細(xì)胞要少的多，因此，對于檢測技術(shù)的準(zhǔn)確性要求高，另一方面是羊水穿刺過程中可能出現(xiàn) 母體遺傳物質(zhì)污染胎兒細(xì)胞DNA的情況，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，因此，胎兒細(xì)胞VHL基因突 變的檢測，需要完善的檢測母體遺傳物質(zhì)污染和排除母體遺傳物質(zhì)污染的方法。因此，目前 亟需一種準(zhǔn)確率高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確的羊水中胎兒細(xì)胞VHL基因突變的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述技術(shù)問題，提供一種用于羊水中胎兒細(xì)胞VHL基 因突變檢測方法，該方法一方面可以準(zhǔn)確檢測和排除母體遺傳物質(zhì)污染，另一方面可以快 速準(zhǔn)確的判斷羊水中胎兒細(xì)胞VHL基因是否存在突變，且檢測成本低。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0006] 1、一種用于羊水中胎兒細(xì)胞VHL基因突變檢測方法。
[0007] 2、一種用于檢測羊水中胎兒細(xì)胞VHL基因突變的試劑盒。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明提供的一種羊水中胎兒細(xì)胞VHL基因突變檢測 方法包括：
[0009] 通過提取羊水中胎兒細(xì)胞的DNA，獲得DNA溶液；
[0010] 對所述的DNA溶液進(jìn)行母體遺傳物質(zhì)污染的檢測，判斷DNA溶液中是否存在母體 遺傳物質(zhì)污染；
[0011] 若判斷DNA溶液中不存在母體遺傳物質(zhì)污染，則直接對羊水中胎兒細(xì)胞進(jìn)行VHL 基因突變檢測；
[0012] 若判斷DNA溶液中存在母體遺傳物質(zhì)污染，則對羊水中胎兒細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行VHL 基因突變檢測。
[0013] 其中，所述VHL基因突變檢測包括：
[0014] 利用VHL基因的三個外顯子E1、E2、E3和內(nèi)參Bg的擴(kuò)增引物和Univ通用引物對 所述DNA溶液進(jìn)行VHL基因大片段缺失的檢測，獲得所述DNA溶液中是否存在大片段缺失 的檢測結(jié)果。
[0015] 其中，所述VHL基因突變檢測還包括：
[0016] 采用VHL基因的三個外顯子VHL-UVHL-2和VHL-3的擴(kuò)增引物對所述DNA溶液進(jìn) 行VHL基因點(diǎn)突變、小片段缺失或插入、剪切位點(diǎn)突變的檢測，獲得所述DNA溶液中是否存 在點(diǎn)突變、小片段缺失或插入、剪切位點(diǎn)突變的檢測結(jié)果。
[0017] 其中，所述母體遺傳物質(zhì)污染檢測包括：
[0018] 人工合成人類性別決定基因SRY和X染色體上的3個短串聯(lián)重復(fù)序列DXS6797、 DXS6807、AR的擴(kuò)增引物對1-4 :
[0019] 利用所述引物對1-4和所述DNA溶液建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0020] 對所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的SRY基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，對所述 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的DXS6797、DXS6807和AR基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行STR分析，根據(jù)所述SRY基 因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果和STR分析結(jié)果判斷所述DNA溶液中是否存在母體遺傳物質(zhì)污染；
[0021] 特別是，所述人類性別決定基因SRY和X染色體上的3個短串聯(lián)重復(fù)序列 DXS6797、DXS6807、AR的擴(kuò)增引物對1-4如SEQ ID No. 1-8所示，分別為：
[0022] 擴(kuò)增引物對 1 :SRY_F :f5' -gagtgaagcgacccatgaac-3'
[0023] SRY-R :5' -tcttgagtgtgtggctttcg-3'
[0024] 擴(kuò)增引物對 2 :DXS6797_F :5' -ttccctctctccctctgtct-3'
[0025] DXS6797-R :5' -acacacacccaaaaccagat-3'
[0026] 擴(kuò)增引物對 3 :DXS6807_F :5' -gagcaatgatctcatttgca-3'
[0027] DXS6807-R :5' -aagtaaacatgtataggaaaaagct-3'
[0028] 擴(kuò)增引物對 4 :AR_F :5' -tccagaatctgttccagagcgtgc-3'
[0029] AR-R :5' -gctgtgaaggttgctgttctccat-3'
[0030] 其中，所述擴(kuò)增引物對2中DXS 6797-F引物的5'端標(biāo)記FAM熒光；
[0031] 其中，所述擴(kuò)增引物對3中DXS 6807-F引物的5'端標(biāo)記FAM熒光；
[0032] 其中，所述擴(kuò)增引物對4中AR-F引物的5 '端標(biāo)記FAM熒光。
[0033] 其中，擴(kuò)增反應(yīng)體系是：總體積為25 y 1，包括12. 5 y 1的PCR mix、20-80ng的 DNA模板、0. 5 y 1的擴(kuò)增引物和余量的ddH20 ;擴(kuò)增反應(yīng)條件為：在95°C溫度條件下預(yù)變性 5min ;95 °C 變性 20s，SRY 基因、DXS6797、DXS680755 °C 退火 20s，AR 58 °C 退火 20s，72 °C 延伸 20s，30個循環(huán)后72°C復(fù)性5min ;4°C保存。
[0034] 其中，所述利用VHL基因的三個外顯子El、E2、E3、內(nèi)參Bg的擴(kuò)增引物和Univ通 用引物所述DNA溶液進(jìn)行VHL基因大片段缺失的檢測包括：
[0035] 人工合成VHL基因的三個外顯子E1、E2、E3和內(nèi)參Bg的擴(kuò)增引物對8-11 :
[0036] 利用所述引物對8-11和所述DNA溶液建立第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行第一輪 PCR反應(yīng)，獲得VHL基因的三個外顯子和內(nèi)參的擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0037] 人工合成VHL基因的三個外顯子和內(nèi)參在第二輪PCR中共用的Univ通用引物對 12 ：
[0038] 利用所述通用引物對12和所述第一輪PCR反應(yīng)中VHL基因的三個外顯子和內(nèi)參 的擴(kuò)增產(chǎn)物建立第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系并進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到帶有熒光的第 二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0039] 將所述得到的帶有熒光的第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)毛細(xì)管電泳 分析結(jié)果，判斷所述DNA是否存在VHL基因的大片段缺失。
[0040] 其中，所述￥1基因的三個外顯子￡^2、￡3、內(nèi)參88的擴(kuò)增引物對8-11及1]11" 通用引物對12如SEQ ID No. 15-24所示，分別為：
[0041]擴(kuò)增引物對 8 E1F: 5' -tccgtcttagctgagtggcgtatacggccctgaagaagacg-3'
[0042] E1R:5' -aggcagaatcgactcaccgctatacctcggtagctgtggatg-3'
[0043]擴(kuò)增引物對 9 E2F:5' -tccgtcttagctgagtggcgtaagacgaggtttcaccacgtt-3'
[0044] E2R:5' -aggcagaatcgactcaccgctagggcttaatttttcaagtggtc-3'
[0045] 擴(kuò)增引物對 10 E3F:5'_tccgtcttagctgagtggcgtatactgagaccctagtctgtcactg_3'
[0046] E3R:5' _aggcagaatcgactcaccgctactaaggaaggaaccagtcctgtat_3'
[0047] 擴(kuò)增引物對 11 BgF:5' -tccgtcttagctgagtggcgtacacaccctagggttggccaa-3'
[0048] BgR:5' -aggcagaatcgactcaccgctaacctgtcttgtaaccttgatac-3'
[0049]通用引物對 12 Univ-F:5' -tccgtcttagctgagtggcgta-3
[0050] Univ-R:5' -FAM-aggcagaatcgactcaccgcta-3'；
[0051] 其中，所述通用引物對12中的Univ-R引物的5'端標(biāo)記有FAM熒光。
[0052] 特別是，所述第一輪PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性10min，94°C變性30s， 58°C退火30s，72°C聚合30s，9個循環(huán)后，72°C延長聚合5min。
[0053] 特別是，所述第二輪PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性10min，94°C變性30s， 60°C退火30s，72°C聚合30s，20個循環(huán)后，72°C延長聚合5min，
[0054] 其中，所述采用VHL基因的三個外顯子VHL-1、VHL-2和VHL-3的擴(kuò)增引物對所述 DNA溶液進(jìn)行VHL基因點(diǎn)突變、小片段缺失或插入、剪切位點(diǎn)突變的檢測包括以下步驟：
[0055] 人工合成VHL基因的三個外顯子VHL-1、VHL-2和VHL-3的擴(kuò)增引物對5-7 ;
[0056] 利用所述引物對5-7和所述DNA溶液建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得 PCR產(chǎn)物；
[0057] 將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化處理和測序分析，判斷所述DNA是否發(fā)生了VHL基因 點(diǎn)突變、小片段缺失或插入和剪切位點(diǎn)突變。
[0058] 其中，所述擴(kuò)增VHL基因的三個外顯子VHL-1、VHL-2和VHL-3的擴(kuò)增引物對5-7 如SEQ ID No. 9-14所示，分別為：
[0059]引物對 5 :VHL_1F 5' -ggtggtctggatcgcgga-3'
[0060] VHL-1R 5' -ggcttcagaccgtgctatcg-3'
[0061]引物對 6 :VHL_2F 5' -gtggctctttaacaacctttgc-3'
[0062] VHL-2R 5' -cctgtacttaccacaacaaccttatc-3'
[0063]引物對 7 :VHL_3F 5' -gcaaagcctcttgttcgttc-3'
[0064] 其中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系是：總體積為25yl，包括12. 5yl的PCR mix、100ng 的DNA模板、1 y 1的引物和余量的ddH20 ;反應(yīng)條件為：94°C lOmin預(yù)變性；94°C變性30s， 58°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)；72°C復(fù)性5min ;4°C保存，獲得PCR產(chǎn)物。
[0065] 其中，所述羊水中胎兒細(xì)胞的培養(yǎng)傳代是將所述羊水中的細(xì)胞在預(yù)先配制的胎兒 細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)溫度為37°C，空氣條件為5%的C02。