一種檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號的rpa引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA引物 及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄卷葉病毒病（Grapevine leafroll-associated virus，GLRaV)是僅次于葡萄 扇葉病毒病的一種世界性葡萄病毒病，在國內(nèi)分布也較為普遍，田間感病率較高，對葡萄產(chǎn) 量和品質(zhì)影響很大，且引起該病的病毒是由葡萄卷葉伴隨病毒單獨或多種葡萄卷葉伴隨病 毒復合侵染造成。現(xiàn)已報道的葡萄卷葉伴隨病毒有11種，分別為GLRaV-1~9、GLRaV-Dr和 GLRaV-De，我國已鑒定明確的葡萄卷葉伴隨病毒種類共有6種，即GLRaV-1~5和7。GLRaV 已被證明屬于典型的Clostero病毒，僅在韌皮部和葉片存在，其傳播不是靠機械，通常是 靠感染的母株或接穗等繁殖材料。GLRaV具有半潛隱性，導致葡萄植株生長衰弱、果實成熟 延遲、果粒大小不均、著色不良、含糖量減少和產(chǎn)量下降，對葡萄的生長發(fā)育有顯著影響。
[0003] 目前，檢測葡萄卷葉病毒的方法主要有指示植物法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、反 轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR)和實時熒光PCR法。指示植物檢測法比較簡單，但其檢測速 度很慢，而且無法確定侵染病毒的種類，靈敏度也較低。國內(nèi)外已有很多利用ELISA方法檢 測葡萄卷葉伴隨病毒的報道，該方法靈敏度高，操作簡單，但所需檢測時間也在1~2天，而 且抗體制備周期長，費用較高，靈敏度不及RT-PCR。利用分子生物學技術(shù)建立的RT-PCR、免 疫捕捉RT-PCR、實時熒光RT-PCR及探針雜交檢測等方法，使得葡萄病毒A的檢測結(jié)果更為 快速、靈敏、準確。但傳統(tǒng)基于PCR的方法需要變性、退火、延伸三個步驟，每個步驟的溫度 不一樣，需要專門的熱循環(huán)儀來進行，限制了其使用范圍。因此許多不依賴PCR儀的等溫擴 增技術(shù)被發(fā)明出來，尤其以LAMP應(yīng)用最為廣泛。
[0004] RPA(Recombinase polymerase ampl if cation)是一項新型的等溫擴增技術(shù)，其主 要原理為利用重組酶和引物形成微絲在模板DNA上搜索到與之完全互補配對的序列時，在 單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫組下使模板DNA解鏈，引物于模板DNA開始配對，并在DNA聚合酶的 作用下復制延伸。該方法主要具備以下優(yōu)點：（1)僅需1對引物即可完成擴增，不需要復雜 的引物設(shè)計過程；（2)只需要37°C下恒溫反應(yīng)即可，不需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備；（3)反應(yīng)時 間僅需40min; (4)結(jié)果易于判斷，不像LAMP產(chǎn)物的彌散帶，RPA擴增產(chǎn)物根據(jù)引物設(shè)計位 點具有特定大小的條帶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的一種檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號 的RPA引物。
[0006] 本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA引物 由SEQID No. 1所示的單鏈DNA分子和SEQID No. 2所示的單鏈DNA分子組成。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨 病毒2號的RPA試劑。
[0008] 本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA試劑 包括上述引物。
[0009] 上述RPA試劑中，所述引物1和所述引物2在所述RPA試劑中的終濃度均為 0?4 y mol/L〇
[0010] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨 病毒2號的試劑盒。
[0011] 本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號的試劑盒 包括上述引物或上述RPA試劑。
[0012] 本發(fā)明還有一個目的是提供上述引物或上述RPA試劑或上述試劑盒的新用途。
[0013] 本發(fā)明提供了上述引物或上述RPA試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測葡萄卷 葉伴隨病毒2號中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供了上述引物或上述RPA試劑或上述試劑盒在制備檢測或輔助檢測 葡萄卷葉伴隨病毒2號產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還提供了上述引物或上述RPA試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測待測 樣品是否感染葡萄卷葉伴隨病毒2號中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還提供了上述引物或上述RPA試劑或上述試劑盒在制備檢測或輔助檢測 待測樣品是否感染葡萄卷葉伴隨病毒2號產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述引物或上述RPA試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測待測 病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明還提供了上述引物或上述RPA試劑或上述試劑盒在制備檢測或輔助檢測 待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的最后一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴 隨病毒2號的方法。
[0020] 本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號的方法包 括如下步驟：
[0021] (1)用上述引物對待測病毒進行RPA擴增，得到RPA擴增產(chǎn)物；
[0022] (2)檢測所述RPA擴增產(chǎn)物的大?。?br>[0023] 若所述RPA擴增產(chǎn)物含有大小為284bp的片段，則所述待測病毒為或候選為葡萄 卷葉伴隨病毒2號；
[0024] 若所述RPA擴增產(chǎn)物不含有大小為284bp的片段，則所述待測病毒不為或候選不 為葡萄卷葉伴隨病毒2號。
[0025] 上述方法中，所述RPA擴增的模板為待測病毒的cDNA。
[0026] 上述方法中，所述RPA擴增的溫度為37 °C，所述RPA擴增的時間為40min。
[0027] 上述方法在檢測或輔助檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保 護范圍。
[0028] 本發(fā)明的方法主要具備以下優(yōu)點：
[0029] (1)僅需1對引物即可完成擴增，不需要復雜的引物設(shè)計過程；
[0030] (2)只需要37°C下恒溫反應(yīng)即可，不需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備；
[0031] (3)反應(yīng)時間僅需40min ;
[0032] (4)結(jié)果易于判斷，不像LAMP產(chǎn)物的彌散帶，RPA擴增產(chǎn)物根據(jù)引物設(shè)計位點具有 特定大小的條帶。
[0033] 本發(fā)明針對葡萄卷葉伴隨病毒2號的HSP70基因的保守序列，設(shè)計特異性RPA擴 增引物，并基于該引物建立了葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA檢測方法，可對葡萄卷葉伴隨病 毒2號進行定性檢測。通過試驗證明：本發(fā)明的RPA擴增引物特異性好、靈敏度高、檢測時 間短、不需要特殊的儀器和適用范圍廣，且基于該引物建立了葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA 檢測方法靈敏、準確、簡便和快速，對進出口相關(guān)貨物及產(chǎn)品檢驗檢疫具有指導意義。
【附圖說明】
[0034] 圖1為RPA檢測方法的建立。其中，1 :葡萄卷葉伴隨病毒2號；2 :陰性對照。
[0035] 圖2為特異性實驗。其中，1 :葡萄卷葉伴隨病毒2號；2 :葡萄卷葉伴隨病毒3號； 3 :沙地葡萄莖痘伴隨病毒；4 :葡萄斑點病毒；5 :葡萄病毒A ;6 :陰性對照。
[0036] 圖3為RPA靈敏度實驗。1-6 :模板cDNA的稀釋度分別為10°、10 \ 10 2、10 3、10 4 和 10 5〇
[0037] 圖4為PCR靈敏度實驗。1-6 :模板cDNA的稀釋度分別為10°、10 \ 10 2、10 3、10 4 和 10 5〇
【具體實施方式】
[0038] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 下述實施例中的RPA擴增試劑盒TwistAmpBasickits是TwistDX公司的產(chǎn)品， 產(chǎn)品目錄號為TABAS03KIT。
[0041 ] 下述實施例中的葡萄卷葉伴隨病毒3號（Grapevine leafroll-associated virus 3)在文獻"王仲，劉命華，李捷，李明駿，程玉琴.3種葡萄卷葉伴隨病毒RT-PCR檢測 [J].中國果樹，2012, 04:43-46. "中公開過，公眾可從伊犁出入境檢驗檢疫局獲得。
[0042] 下述實施例中的葡萄卷葉伴隨病毒2號（Grapevine leafroll-associated virus 2)在文獻"趙靜靜，乾義柯，頡超，郭慶元，胡白石，陸平.引起葡萄黃化類癥狀的病毒 和類病毒RT-PCR檢測[J].新疆農(nóng)業(yè)科學，2015, 06:1099-1104"中公開過，公眾可從伊犁 出入境檢驗檢疫局獲得。
[0043] 下述實施例中的沙地葡萄莖痘伴隨病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus)、葡萄斑點病毒（Grapevine fleck virus)及葡萄病毒 A (Grapevine virus A)均為在文獻"梁巧玲，乾義柯，張娜，陸平，劉緒斌.新疆三種葡萄病毒RT-PCR 檢測及序列分析[J].植物保護學報，2015, 03:376-381. "中公開過，公眾可從伊犁出入境 檢驗檢疫局獲得。
[0044] 實施例1、用于檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA引物及其RPA試劑盒
[0045] 一、RPA引物的設(shè)計
[0046] 針對葡萄卷葉伴隨病毒2號的外殼蛋白基因的保守序列，設(shè)計檢測葡萄卷葉病毒 2的RPA引物，產(chǎn)物大小為284bp。具體序列如下：
[0047] 上游引物 GLRaV2-F :5，-CGGTCTCGTCATAACCGACGCTTCTAGTTTGAATG-3，（序列 1);
[0048] 下游引物 GLRaV2-R :5 ' -TGAATCTATTAAGAGGTGCGCACCCTTCAAGCACT-3 '(序列 2)〇
[0049] 二、用于檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA試劑盒及其使用方法
[0050] 1、用于檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA試劑盒
[0051] 用于檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA試劑盒包括上述步驟一設(shè)計的上游引物 GLRaV2-F和下游引物GLRaV2-R、含凍干酶粉管、再水化緩沖液（Rehydration Buffer)、醋 酸鎂溶液（280mmol/L)。上述含凍干酶粉管、再水化緩沖液（Rehydration Buffer)和醋酸 鎂溶液（280mmol/L)均來源于RPA擴增試劑盒TwistAmp Basic kits。
[0052] 2、用于檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA試劑盒的使用方法
[0053] (l)RPA 擴增
[0054] 以待測樣品的cDNA為模板，采用GLRaV2-F和GLRaV2-R引物進行RPA擴增，得到 RPA擴增產(chǎn)物。同時設(shè)置空白對照（DNA模板為超純水）。
[0055] RPA擴增體系的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0. 2mL TwistAmp反應(yīng)管中加入 再水化緩沖液（Rehydration Buffer) 29. 5 y L、去離子水12. 5 y L、上、下游