微藻生物質(zhì)蛋白質(zhì)富集方法
【專利說明】微藻生物質(zhì)蛋白質(zhì)富集方法
[0001] 本發(fā)明涉及一種微藻生物質(zhì)的蛋白質(zhì)富集的方法，所述微藻更具體地是小球藻 屬（Chlorella)，甚至更具體地是耐熱性小球藻（Chlorella sorokiniana)或原殼小球藻 (Chlorella protothecoides)物種。
[0002] 藻類一大型藻和微藻一具有特殊但大多未經(jīng)開發(fā)的豐富性。它們?cè)谑澄铩⒒瘜W(xué)品 和生物能源生產(chǎn)中的應(yīng)用仍極少。然而，它們隱藏著具有巨大價(jià)值的組分，只有以其為食的 海洋動(dòng)物才能真正了解這些組分的豐富性和豐度。
[0003] 事實(shí)上，微藻是維生素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖、色素和抗氧化劑的來源。
[0004] 因此，藻類和微藻受到使用它們來生產(chǎn)膳食補(bǔ)充劑、功能性食物、化妝品或藥物或 進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖的工業(yè)的關(guān)注。
[0005] 最重要的是，微藻是定殖于所有曝露于光的群落生境的光合微生物。
[0006] 在工業(yè)規(guī)模上，其單克隆培養(yǎng)是在光生物反應(yīng)器（自養(yǎng)條件：具有光和C02)中進(jìn) 行，或者對(duì)于一些微藻，也是在發(fā)酵罐（異養(yǎng)條件：在黑暗中在一種碳源存在下）中進(jìn)行。
[0007] 事實(shí)上，少數(shù)微藻物種能在無光下生長(zhǎng)：小球藻屬、菱形藻屬（Nitzschia)、小環(huán) 藻屬（Cyclotella)、四爿藻屬（Tetraselmis)、隱甲藻屬（Crypthecodinium)、裂壺藻屬 (Schizochytrium)〇
[0008] 此外，據(jù)估計(jì)在異養(yǎng)條件下培養(yǎng)的成本是在光養(yǎng)條件下培養(yǎng)成本的1/10,這是因 為對(duì)于技術(shù)人員來說，異養(yǎng)條件使得以下各項(xiàng)成為可能：
[0009] -使用與用于細(xì)菌和酵母的發(fā)酵罐相同并且容許控制所有培養(yǎng)參數(shù)的發(fā)酵罐。
[0010] -所產(chǎn)生生物質(zhì)的量顯著大于基于光的培養(yǎng)所獲得的量。
[0011] 善用微藻一般需要控制發(fā)酵條件以積累所關(guān)注組分，例如：
[0012] -色素（葉綠素a、b和c、e-胡蘿卜素、蝦青素、葉黃素、藻藍(lán)蛋白、黃葉素、藻紅 蛋白等），其需求因其顯著的抗氧化性質(zhì)以及在食物中提供天然色彩而日益增加，
[0013] -蛋白質(zhì)，以優(yōu)化微藻的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量；或
[0014] -脂質(zhì)，以優(yōu)化微藻的脂肪酸含量（以其干物質(zhì)重量計(jì)高達(dá)60%，甚至80% )，尤 其用于：
[0015] ?生物燃料應(yīng)用，以及
[0016] ?人類或動(dòng)物食物應(yīng)用（當(dāng)所選微藻產(chǎn)生所謂的"必需"（即，因人類或動(dòng)物無法 天然產(chǎn)生而在膳食中提供）多不飽和脂肪酸或PUFA時(shí)）。
[0017] 因此，為獲得這種結(jié)果，充分研究了第一種高細(xì)胞密度（HCD)發(fā)酵方法，以獲得蛋 白質(zhì)或脂質(zhì)的最大產(chǎn)率和產(chǎn)量。
[0018] 這些HCD培養(yǎng)的目標(biāo)是在最短時(shí)間內(nèi)以盡可能最高的濃度獲得所需產(chǎn)物。
[0019] 例如，針對(duì)祖芬氏小球藻（Chlorella zofingiensis)的奸青素的生物合成來驗(yàn) 證這個(gè)方案，其中證實(shí)這些微藻的生長(zhǎng)與這種化合物的產(chǎn)生直接相關(guān)（王（Wang)和彭 (Peng)，2008,世界微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志（World J Microbiol. Biotechnol.)，24 (9)， 1915-1922)。
[0020] 然而，維持其生長(zhǎng)處于最大速率（y，以h 1計(jì)）的事實(shí)與所需產(chǎn)物的高產(chǎn)量并非 始終相關(guān)。
[0021] 事實(shí)上，業(yè)內(nèi)專家很快就了解到，為了讓微藻產(chǎn)生大儲(chǔ)量的脂質(zhì)，需要例如使這些 微藻經(jīng)受限制其生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)壓力。
[0022] 現(xiàn)在，在發(fā)酵方法中解除了生長(zhǎng)與產(chǎn)量的關(guān)系。
[0023] 例如，為促進(jìn)多不飽和脂肪酸（本文中為二十二碳六烯酸或DHEA)的積累，專利申 請(qǐng)W0 01/54510建議解除細(xì)胞生長(zhǎng)與多不飽和脂肪酸產(chǎn)生之間的關(guān)聯(lián)。
[0024] 因此，在微藻裂壺藻屬株系A(chǔ)TCC 20888中，在沒有氧限制下進(jìn)行第一生長(zhǎng)期，以 促進(jìn)高細(xì)胞密度（大于l〇〇g/l)的產(chǎn)生；然后，在第二步驟中，供氧逐步減少，以對(duì)這些微藻 施加壓力，從而減慢其生長(zhǎng)并起始所關(guān)注的脂肪酸的產(chǎn)生。
[0025] 在微藻寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii)中，以低葡萄糖濃度（約5g/l) 且因此具有低生長(zhǎng)速率來獲得最高二十二碳六烯酸（DHEA，多不飽和脂肪酸）含量，（江 (Jiang)和陳（Chen)，2000,生物化學(xué)工藝（Process Biochem. )，35 (10)，1205-1209)。
[0026] 這些結(jié)果明確說明，產(chǎn)物形成的動(dòng)力學(xué)可與微藻生長(zhǎng)呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，甚至呈 二者的組合。
[0027] 因此，在產(chǎn)物形成與高細(xì)胞生長(zhǎng)無關(guān)的情形中，控制細(xì)胞生長(zhǎng)速率是明智的。
[0028] -般來說，技術(shù)人員選擇通過控制發(fā)酵條件（Tp、pH等）或通過控制營(yíng)養(yǎng)組分向發(fā) 酵培養(yǎng)基的供應(yīng)（半連續(xù)，所謂的"分批給料"條件）來控制微藻生長(zhǎng)。
[0029] 如果技術(shù)人員選擇在異養(yǎng)條件下借助碳源供應(yīng)來控制微藻生長(zhǎng)，那么他/她一般 選擇根據(jù)所產(chǎn)生的代謝物（例如，DHEA型多不飽和脂肪酸）調(diào)整給予微藻（寇氏隱甲藻、 纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis)等）的碳源（純葡萄糖、乙酸鹽、乙醇等）。
[0030] 溫度也可以是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)：
[0031] _例如，已報(bào)道，某些微藻物種的多不飽和脂肪酸合成，例如極微小球藻 (Chlorella minutissima)的EPA合成，在低于所述微藻的最佳生長(zhǎng)所需溫度的溫度下被 促進(jìn)；
[0032] -相反，異養(yǎng)生長(zhǎng)的原殼小球藻的葉黃素產(chǎn)率在生產(chǎn)溫度從24°C升高到35°C時(shí)較 尚。
[0033] 原殼小球藻無可非議地被公認(rèn)為最佳產(chǎn)油微藻之一。
[0034] 在異養(yǎng)條件下，其將碳水化合物快速轉(zhuǎn)變?yōu)楦视腿ィù笥谄涓晌镔|(zhì)的50%)。
[0035] 為了優(yōu)化這種甘油三酯生產(chǎn)，技術(shù)人員通過作用于發(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境來優(yōu)化 朝向油產(chǎn)生的碳通量。
[0036] 由此得知，在供應(yīng)足量碳，但在無氮條件下時(shí)，油積累。
[0037] 因此，此處C/N比率是決定性的，并且已確認(rèn)，最佳結(jié)果是在不限制葡萄糖含量 時(shí)，直接作用于氮含量來獲得。
[0038] 不出所料，這種氮缺乏影響細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)速率比正常微藻生長(zhǎng)速率降低 3〇% (熊（Xiong)等人，植物生理學(xué)（Plant Physiology)，2〇10，154,第 1001-1011 頁）。
[0039] 為了解釋這個(gè)結(jié)果，熊等人在上文所提到的文章中顯示，事實(shí)上，如果將小球藻 生物質(zhì)分為五種主要組分，也就是碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA和RNA(占其干物質(zhì)的 85% )，如果C/N比率對(duì)DNA、RNA和碳水化合物含量無影響，那么蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量變得突 出。
[0040] 因此，以低C/N比率生長(zhǎng)的小球藻細(xì)胞含有25. 8 %的蛋白質(zhì)和25. 23 %的脂質(zhì)，而 高C/N比率使得能合成53. 8%的脂質(zhì)和10. 5%的蛋白質(zhì)。
[0041] 因此為了優(yōu)化油產(chǎn)生，技術(shù)人員必須通過將碳通量轉(zhuǎn)向油產(chǎn)生來控制碳通量，以 降低蛋白質(zhì)產(chǎn)生；在將這些微藻置于無氮培養(yǎng)基中時(shí)，該碳通量被重新分配并在脂質(zhì)儲(chǔ)存 物質(zhì)中積累。
[0042] 根據(jù)這個(gè)教導(dǎo)，為產(chǎn)生富含蛋白質(zhì)的生物質(zhì)，技術(shù)人員實(shí)施與此相反的代謝控制， 也就是應(yīng)用代之以促進(jìn)低C/N比率的發(fā)酵條件，并且因此：
[0043] ~-向發(fā)酵培養(yǎng)基供應(yīng)大量氮源，同時(shí)使將轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的碳源的載荷維持恒 定；并且
[0044] ~-刺激這些微藻生長(zhǎng)。
[0045] 這就是將碳通量修改為朝向蛋白質(zhì)產(chǎn)生（且因此朝向生物質(zhì)產(chǎn)生），以減少儲(chǔ)存 脂質(zhì)的產(chǎn)生。
[0046] 在本發(fā)明背景下，申請(qǐng)人公司選擇通過披露技術(shù)人員的傳統(tǒng)設(shè)想的一個(gè)替代性解 決方案來探索一條新路徑。
[0047] 因此，本發(fā)明涉及一種異養(yǎng)生長(zhǎng)的微藻的蛋白質(zhì)富集的方法，所述微藻屬于小球 藻屬，更具體地為耐熱性小球藻或原殼小球藻，所述異養(yǎng)培養(yǎng)方法包含旨在借助發(fā)酵培養(yǎng) 基中非氮營(yíng)養(yǎng)源的缺乏來限制所述微藻生長(zhǎng)的步驟。
[0048] 這個(gè)步驟是一個(gè)異養(yǎng)培養(yǎng)步驟，其中在培養(yǎng)基中以不足以容許微藻生長(zhǎng)的量供應(yīng) 非氮營(yíng)養(yǎng)因子。應(yīng)注意，"不足……的量"并不意味著不供應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)因子。這個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺乏 期的結(jié)果是減慢（限制）細(xì)胞代謝，但并非完全抑制代謝。
[0049] 在本發(fā)明的意圖中，"富集"是指生物質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量增加至少15重量％，優(yōu)選 地至少20重量％，使得該生物質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量達(dá)到超過50重量％。
[0050] 更具體地，本發(fā)明涵蓋所述微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)的方法，該方法包含旨在借助發(fā)酵培 養(yǎng)基中非氮營(yíng)養(yǎng)源的缺乏來限制所述微藻生長(zhǎng)