重組酵母轉(zhuǎn)化體和用其制備免疫球蛋白Fc片段的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組酵母轉(zhuǎn)化體、和用其制備免疫球蛋白Fc片段的方法。更具體地， 本發(fā)明涉及通過將包括編碼人免疫球蛋白Fc片段的多核苷酸的表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母屬 (Pichia sp.)酵母制備的轉(zhuǎn)化體；生產(chǎn)免疫球蛋白Fc片段的方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體和從培 養(yǎng)物回收免疫球蛋白Fc片段；和通過上述方法制備的免疫球蛋白Fc片段，用作藥物載體。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生物工程和生物技術(shù)的進(jìn)步，已研發(fā)出許多生物活性多肽（蛋白質(zhì)）和肽藥 物作為多種疾病的治療選擇。然而，由于其低穩(wěn)定性，這種多肽或肽藥物容易變性，因此非 常容易被腎或肝清除。因此，包括多肽作為醫(yī)學(xué)活性成分的蛋白質(zhì)藥物具有必須頻繁給予 患者以維持其適當(dāng)血清水平和效價(jià)的缺點(diǎn)。因此研發(fā)能夠在不頻繁給予的情況下在體內(nèi)維 持適當(dāng)水平的蛋白質(zhì)藥物至關(guān)重要。
[0003] 為解決這些問題，很多嘗試致力于提高蛋白質(zhì)藥物的血清穩(wěn)定性和長時(shí)間維持血 液高藥物濃度水平以最大化藥物的藥效，因此已嘗試與其它蛋白質(zhì)或結(jié)合聚合物融合，提 高蛋白質(zhì)配制的變化。近年來最好的方法其中之一致力于免疫球蛋白與蛋白質(zhì)的融合。
[0004] 已做出很多嘗試來通過利用免疫球蛋白和其片段增加蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性，如美 國專利號5, 045, 312所述，其中人生長激素通過交聯(lián)劑綴合至牛血清白蛋白或小鼠免疫球 蛋白。綴合物與無修飾的生長激素相比具有增強(qiáng)的活性。還制備了其它多種在使免疫球蛋 白的Fc片段連接至干擾素（韓國專利公開號10-2003-0009464)、白介素-4受體、白介素-7 受體或促紅細(xì)胞生成素（韓國專利號10-249572)后在哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的融合蛋白。PCT 專利公開號W0 01/03737公開了一種融合蛋白，其中細(xì)胞因子或生長因子通過寡肽連接物 連接至免疫球蛋白的Fc片段。而且，美國專利號5, 116, 964描述了利用基因重組技術(shù)融合 至免疫球蛋白Fc片段的氨基或羧基端的蛋白質(zhì)。美國專利號5, 349, 053公開了其中IL-2 通過肽連接物連接至免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白。
[0005] 很多其它利用基因重組技術(shù)構(gòu)建的Fc融合蛋白已被公開，其實(shí)例包括免疫球蛋 白Fc片段與干擾素或其衍生物的融合蛋白（PCT專利公開號W0 00/23472)、和免疫球 蛋白Fc片段與IL-5受體的融合蛋白（美國專利號5, 712, 121)。進(jìn)一步，免疫球蛋白Fc片 段已被用作載體，而非融合配體，如美國專利號7, 736, 653公開。
[0006] 免疫球蛋白或免疫球蛋白Fc片段的生產(chǎn)主要在大腸桿菌（E.coli)中進(jìn)行。 美國公司AmgenInc.在美國專利號6, 660, 843和美國專利公開號2004-0044188和 2004-0053845中描述了一種人IgGIFc衍生物，其鉸鏈區(qū)前五個(gè)氨基酸殘基的氨基酸被刪 除，其融合至治療蛋白或肽模擬治療蛋白的氨基或羧基末端；和其利用大腸桿菌宿主的生 產(chǎn)。然而，這種不具有信號序列的融合蛋白作為包含體表達(dá)，因此一定會(huì)經(jīng)歷額外的重折疊 過程。這種蛋白質(zhì)重折疊過程降低產(chǎn)率，特別在作為同質(zhì)二聚體或異質(zhì)二聚體存在的蛋白 質(zhì)中，明顯減少二聚體產(chǎn)量。而且，當(dāng)不具有信號序列的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，基于 大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)，甲硫氨酸殘基添加至表達(dá)產(chǎn)物的N端。上述AmgenInc. 的表達(dá)產(chǎn)物具有N端甲硫氨酸殘基，其在反復(fù)或過度給予身體時(shí)可引起免疫應(yīng)答。而且，由 于通過將編碼治療蛋白的基因連接至Fc基因來在大腸桿菌中以融合蛋白形式表達(dá)這些融 合分子，其難以在大腸桿菌中表達(dá)，并且治療蛋白難以在大腸桿菌中生成一一如果其以融 合形式在大腸桿菌中表達(dá)導(dǎo)致活性顯著減少或喪失。進(jìn)一步，由于兩種分子的融合在兩種 蛋白質(zhì)之間的連接區(qū)產(chǎn)生非天然存在的異常氨基酸序列，該融合蛋白可能被免疫系統(tǒng)認(rèn)作 外源物質(zhì)，因此引起免疫應(yīng)答。
[0007] 如上所述，使用大腸桿菌的優(yōu)勢之處在于治療有效的蛋白質(zhì)可以基于大腸桿菌的 快生長速率以及發(fā)酵和生物工程的積累技術(shù)以非糖基化形式以高產(chǎn)率表達(dá)，但劣勢之處在 于重組蛋白與天然蛋白相比具有甲硫氨酸作為第一個(gè)氨基端殘基，并且考慮到大腸桿菌衍 生的熱原（內(nèi)毒素）的去除和蛋白質(zhì)重折疊，需要復(fù)雜的純化過程。
[0008] 另一方面，使用動(dòng)物細(xì)胞有利的是生產(chǎn)的融合蛋白是與天然免疫球蛋白形式同類 的糖基化蛋白質(zhì)，但不利的是具有高生產(chǎn)成本，并且非常容易被動(dòng)物衍生的病毒或蛋白質(zhì) 污染。因此，對上述問題解決方案的需求正在增加。推薦利用同時(shí)具有大腸桿菌和動(dòng)物細(xì) 胞作為宿主細(xì)胞的優(yōu)勢的酵母的策略。
[0009] 酵母中用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的代表是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。除對 人體安全外，真核生物釀酒酵母還容易遺傳操縱和大規(guī)模培養(yǎng)。而且，真核生物的多種表 達(dá)系統(tǒng)已被建立。在利用重組方法生產(chǎn)高級細(xì)胞衍生的蛋白質(zhì)如人蛋白質(zhì)時(shí)，這種微生物 另外提供給蛋白質(zhì)在細(xì)胞外分泌和翻譯后修飾（如通過糖基化）的能力。另外，酵母的重 組蛋白在分泌信號驅(qū)動(dòng)的胞外分泌期間進(jìn)行折疊、和二硫鍵形成、糖基化，因此演變成完全 生物活性形式。酵母還在經(jīng)濟(jì)上有利，因?yàn)槠洳恍枰托始?xì)胞溶解和蛋白質(zhì)重折疊。然 而，釀酒酵母的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)已顯示的問題是，根據(jù)人蛋白質(zhì)種類，分泌速率有很大差 異。通常，作為高價(jià)值人用藥物使用的蛋白質(zhì)難以在釀酒酵母中表達(dá)和分泌（韓國專利號 10-0798894)。
[0010] 發(fā)明的公開內(nèi)容
[0011] 技術(shù)問題
[0012] 關(guān)于本發(fā)明，發(fā)明人進(jìn)行的關(guān)于酵母在生產(chǎn)蛋白質(zhì)用于人用藥物中的應(yīng)用的大量 且全面的研究導(dǎo)致如下發(fā)現(xiàn)：畢赤酵母屬酵母，一種甲醇營養(yǎng)型酵母物種，可用于在無額外 重折疊過程也無用額外氨基酸進(jìn)行N端修飾的情況下以高表達(dá)水平生產(chǎn)可用作藥物載體 的分泌型免疫球蛋白Fc片段，并且分泌型免疫球蛋白Fc片段可用簡單方法純化，具有最低 負(fù)載（load)的內(nèi)毒素或動(dòng)物衍生型外源病原。
[0013] 問題的解決方案
[0014] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供轉(zhuǎn)化體，其通過將包括編碼人免疫球蛋白Fc片段的多 核苷酸的表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母屬酵母來制備。
[0015] 本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)免疫球蛋白Fc片段的方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，和從 培養(yǎng)物回收免疫球蛋白Fc片段。
[0016] 本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供通過該方法生產(chǎn)的免疫球蛋白Fc片段，用作藥物載 體。
[0017] 發(fā)明的有益效果
[0018]本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)化體可克服與大腸桿菌或動(dòng)物細(xì)胞在生產(chǎn)免疫球蛋白Fc片段時(shí) 用作宿主細(xì)胞相關(guān)的問題，可用作藥物載體，并且可在藥物的高效和經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)中得到應(yīng)用。
[0019] 附圖簡述
[0020] 圖1是示例重組表達(dá)載體pPIC9K_IgG4Fc的構(gòu)建方法的示意圖。
[0021] 圖2是示例重組表達(dá)載體pPIC9K-mPSCFc的構(gòu)建方法的示意圖。
[0022] 圖3是顯示目標(biāo)基因通過3mg/ml和4mg/ml遺傳霉素（Geneticin)整合入選定的 多拷貝克隆基因組DNA的PCR圖。
[0023] 實(shí)施發(fā)明的最佳方式
[0024] 在這方面的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過將包括編碼人免疫球蛋白Fc片段 的多核苷酸的表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母屬酵母而修飾的轉(zhuǎn)化體。
[0025] 如本文所用，術(shù)語"免疫球蛋白"，也被稱為"抗體"，指代由免疫系統(tǒng)響應(yīng)抗原刺激 生成并且在警戒（vigilance)期間通過血液和淋巴特異性地結(jié)合至具體抗原以發(fā)生抗原 抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白基本上由兩條相同的全長輕鏈和兩條相同的全長重鏈組 成，重鏈之間以及重鏈和輕鏈之間通過二硫鍵連接。重鏈基于其恒定區(qū)氨基酸序列的差異 具有五種不同類型：gamma( y )、mu ( y )、alpha( a )、delta( 5 )和 epsilon ( e )，并且重鏈 包括下列子類：ga_a 1 ( y 1)、ga_a 2 ( y 2)、ga_a 3 ( y 3)、ga_a 4 ( y 4)、alpha 1 ( a 1) 和alpha 2(a2)。根據(jù)重鏈恒定區(qū)的特征，免疫球蛋白分成五種同種型：IgG、IgA、IgD、IgE 和IgM。代表性同種型IgG進(jìn)一步分成IgGl、IgG2、IgG3和IgG