利用植物干細(xì)胞或植物去分化干細(xì)胞的提取物誘導(dǎo)定制亞全能干細(xì)胞的方法以及利用該 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用植物干細(xì)胞和/或植物去分化干細(xì)胞的提取物通過重新編程分化的成人細(xì)胞和/或使分化的成人細(xì)胞去分化來誘導(dǎo)定制亞全能干細(xì)胞的方法、利用該方法制得的亞全能干細(xì)胞以及包含所述亞全能干細(xì)胞的細(xì)胞治療劑。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞是存在于胚胎、胎兒和成人組織中的未分化的細(xì)胞類型的總稱，其特點(diǎn)在于分化成多種特定細(xì)胞類型的能力。在各種分類的干細(xì)胞中，亞全能干細(xì)胞是指這樣的細(xì)胞，其可分化成衍生自構(gòu)成生物體的三個胚層中的任何一層的細(xì)胞。
[0003]在分類中，干細(xì)胞可以根據(jù)解剖區(qū)域、細(xì)胞功能、細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原類型、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)以及可由干細(xì)胞生成的特定細(xì)胞的類型來進(jìn)行分類。
[0004]其中最常用的標(biāo)準(zhǔn)之一是干細(xì)胞所衍生的來源。干細(xì)胞可以被分類為從胚胎中分離的胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和從成人分離的成體干細(xì)胞。
[0005]根據(jù)另一個常用的分類法對由干細(xì)胞分化的細(xì)胞類型的數(shù)量進(jìn)行分類，干細(xì)胞可被分類為亞全能(pluripotency)干細(xì)胞、多能(multipotency)干細(xì)胞和單能(unipotent)干細(xì)胞。一般情況下，胚胎干細(xì)胞是代表性的亞全能干細(xì)胞，成體干細(xì)胞被分為多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞。
[0006]在受精后于哺乳動物的早期發(fā)育形成的胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)是隨后形成胚胎的一部分，并且由內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形成的胚胎干細(xì)胞可被稱為亞全能干細(xì)胞，具有分化成構(gòu)成個體的所有組織的細(xì)胞的潛能。也就是說，與成體干細(xì)胞相比較而言，胚胎干細(xì)胞是未分化的細(xì)胞，其能夠增殖但不限于分化成所有類型的細(xì)胞，還形成生殖細(xì)胞，并且因此可以遺傳給下一代。
[0007]然而，這些胚胎干細(xì)胞即亞全能干細(xì)胞的制備導(dǎo)致人類胚胎被破壞，這引起了宗教和倫理問題。此外，由于胚胎干細(xì)胞衍生自有限的胚胎，因此每個個體之間缺乏免疫相容性，并且因此在胚胎干細(xì)胞用作細(xì)胞治療劑的開發(fā)中可能存在移植排斥。為了解決這些問題，已經(jīng)通過利用成人來源細(xì)胞進(jìn)行多種嘗試以人為制備模擬胚胎干細(xì)胞的亞全能干細(xì)胞。
[0008]代表性方法的實(shí)例包括體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)，ES細(xì)胞融合物，由所限定的因子重新編程等等。SCNT需要大量的卵母細(xì)胞，由于其效率非常低。ES細(xì)胞融合物具有穩(wěn)定性問題，因?yàn)橛纱苏T導(dǎo)的亞全能干細(xì)胞包含兩個額外的基因?qū)ΑＭㄟ^所限定的因子重新編程，這是最近的技術(shù)，其采用含有致癌基因的病毒，并因此可能引起致癌性。
[0009]為了確保定制亞全能干細(xì)胞用于細(xì)胞療法的開發(fā)，需要開發(fā)制備亞全能干細(xì)胞的方法，其安全并且可解決倫理問題。根據(jù)這一需求，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)利用衍生自動物的誘導(dǎo)亞全能干細(xì)胞(iPS)的提取物開發(fā)了去分化干細(xì)胞，但也有一些限制。
[0010]首先，需要約20mg或更多的iPS提取物實(shí)施上述方法。因此，其中提取物是從人去分化干細(xì)胞中分離出的去分化誘導(dǎo)需要大量的成本和勞動，尚未成功。例如，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員必須耗時3個月或以上來制備人去分化干細(xì)胞以獲得20mg提取物，這需要很高的成本。
[0011]其次，動物干細(xì)胞或與其對應(yīng)的去分化干細(xì)胞沒有完全粉碎并殘留在分離提取物的過程中，當(dāng)利用所述提取物處理待誘導(dǎo)去分化的體細(xì)胞時，難以將誘導(dǎo)去分化的細(xì)胞和提取物中殘留的去分化干細(xì)胞區(qū)分開來，并且因此可能無法立即確定實(shí)驗(yàn)成功與否，而可以在分析其基因組DNA后確定。因此，可能浪費(fèi)大量的時間和成本。
[0012]再次，由于很少利用蛋白質(zhì)制得的人去分化干細(xì)胞，所以使用了利用病毒產(chǎn)生的人去分化干細(xì)胞的提取物。然而，該提取物可能含有由所述病毒引起的致癌物質(zhì)，這可能是臨床應(yīng)用的一個障礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

技術(shù)問題
[0013]開發(fā)本發(fā)明以解決如上所述的常規(guī)技術(shù)的問題，并提供了制備定制亞全能干細(xì)胞的方法，確保安全性并沒有倫理問題。此外，提供了誘導(dǎo)人去分化干細(xì)胞的方法，這是難以利用現(xiàn)有技術(shù)來實(shí)現(xiàn)的。
[0014]本發(fā)明的發(fā)明人已開發(fā)了通過利用成人來源細(xì)胞誘導(dǎo)具有與從其中分離細(xì)胞的成人的遺傳背景相同的亞全能干細(xì)胞的方法。因此，本發(fā)明將提議本發(fā)明實(shí)施方案的方法適用于通過提供與具有不同遺傳背景的成人來源細(xì)胞相同的結(jié)果來制備亞全能干細(xì)胞。
技術(shù)解決方案
[0015]為了解決上述技術(shù)主題，本發(fā)明提供了通過利用植物來源干細(xì)胞的提取物誘導(dǎo)亞全能干細(xì)胞的方法。
[0016]更具體地，本發(fā)明提供了制備定制亞全能干細(xì)胞的方法，包括:制備任何植物干細(xì)胞或者誘導(dǎo)的亞全能植物干細(xì)胞的提取物；將所述提取物導(dǎo)入到成人來源細(xì)胞中；以及培養(yǎng)所述成人來源細(xì)胞以制備具有與胚胎干細(xì)胞的多能性相同的亞全能干細(xì)胞。
[0017]所述提取物包括從植物細(xì)胞獲得的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖和酸。
[0018]所述提取物包括愈傷組織粉末。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，本發(fā)明進(jìn)一步包括在將提取物引進(jìn)到成人來源細(xì)胞中之前利用培養(yǎng)基處理步驟a)的提取物。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案，本發(fā)明可進(jìn)一步包括在將提取物導(dǎo)入到成人來源細(xì)胞中之前利用膜滲透促進(jìn)組分處理成人來源細(xì)胞。所述膜滲透促進(jìn)組分可以是蛋白質(zhì)或化合物，包括鏈球菌溶血素O和毛地黃皂苷。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的又一個實(shí)施方案，本發(fā)明還可進(jìn)一步包括將其中導(dǎo)入所述提取物的成人來源細(xì)胞轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)細(xì)胞層上并進(jìn)行培養(yǎng)。飼養(yǎng)細(xì)胞可包括STO細(xì)胞。
[0022]此外，本發(fā)明提供了制備定制亞全能干細(xì)胞的方法，包括:制備任何植物干細(xì)胞或者誘導(dǎo)的亞全能植物干細(xì)胞的提取物；將所述提取物導(dǎo)入到成人來源細(xì)胞中；以及在普通細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述成人來源細(xì)胞；將所述成人來源細(xì)胞轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)細(xì)胞層上，并在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)成人來源細(xì)胞。
[0023]此外，本發(fā)明提供利用上述方法制備的亞全能干細(xì)胞，其與胚胎干細(xì)胞非常相似。
[0024]此外，本發(fā)明提供一種包含所述亞全能干細(xì)胞的細(xì)胞治療劑。
[0025]此外，本發(fā)明提供了治療疾病的方法，其包括施用藥學(xué)上有效量的細(xì)胞治療劑。
[0026]此外，本發(fā)明提供了所述亞全能干細(xì)胞作為細(xì)胞治療劑的有效成分的用途。
有利效果
[0027]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，植物干細(xì)胞或誘導(dǎo)的亞全能植物干細(xì)胞的提取物可用作制備定制干細(xì)胞的最有效的方法。此外，這種方法將是可廣泛應(yīng)用的制備方法，覆蓋所有類型的細(xì)胞，包括具有不同遺傳背景的人。此外，本發(fā)明實(shí)施方案的方法利用植物來源干細(xì)胞的提取物，從而允許制備定制亞全能干細(xì)胞，不會引起倫理問題并確保安全性。
【附圖說明】
[0028]圖1是舉例說明根據(jù)本發(fā)明的方法誘導(dǎo)定制亞全能干細(xì)胞的整體過程的示意圖。
[0029]圖2是舉例說明利用植物干細(xì)胞提取物處理后第5天誘導(dǎo)的亞全能干細(xì)胞的圖。
[0030]圖3是舉例說明利用植物干細(xì)胞提取物處理后第8天以及被轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)細(xì)胞層上后第2天誘導(dǎo)的亞全能干細(xì)胞的圖。
[0031]圖4A是利用植物干細(xì)胞提取物處理后第32天以及被轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)細(xì)胞層上并傳代4次后誘導(dǎo)的亞全能干細(xì)胞和的圖。圖4B是舉例說明典型的胚胎干細(xì)胞的圖。
[0032]圖5是舉例說明利用植物干細(xì)胞提取物處理后第32天以及被轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)細(xì)胞層上并傳代4次后誘導(dǎo)的亞全能干細(xì)胞的堿性磷酸酶試驗(yàn)結(jié)果的圖。
[0033]圖6A是舉例說明利用植物干細(xì)胞提取物處理后第50天以及被轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)細(xì)胞層上并傳代7次后誘導(dǎo)的亞全能干細(xì)胞的圖(左)以及舉例說明其堿性磷酸酶試驗(yàn)結(jié)果的圖(右)。圖6B是舉例說明通過病毒遞送四種Yamanaka因子誘導(dǎo)的人亞全能干細(xì)胞的圖(左)以及舉例說明其堿性磷酸酶試驗(yàn)結(jié)果的圖(右)。
[0034]圖7是舉例說明根據(jù)本發(fā)明的方法誘導(dǎo)的亞全能