使用hb9調(diào)節(jié)子使人胚胎干細胞分化為胰腺內(nèi)分泌細胞的方法
【專利說明】使用HB9調(diào)節(jié)子使人胚胎干細胞分化為胰腺內(nèi)分泌細胞的 方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求美國臨時申請61/747, 672 (2012年12月31日提交）的優(yōu)先權，該美 國臨時申請全文以引用方式并入本文。
技術領域
[0003] 本發(fā)明所屬領域為細胞分化領域。更具體地，本發(fā)明涉及將特定的甲狀腺激素或 其類似物、和ALK5抑制劑用作胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌細胞的HB9調(diào)節(jié)子。
【背景技術】
[0004] I型糖尿病的細胞替代療法在不斷推進，同時可移植胰島又一直短缺，這使人們重 點著眼于擴大適于移植產(chǎn)胰島素細胞（即0細胞）的來源。一種方法是由多能干細胞（例 如胚胎干細胞）產(chǎn)生功能性0細胞。
[0005] 在脊椎動物的胚胎發(fā)育期間，多能細胞在稱為原腸胚形成的過程中產(chǎn)生包括三個 胚層（外胚層、中胚層和內(nèi)胚層）的細胞群。例如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟之類的組織 將從內(nèi)胚層經(jīng)由中間階段發(fā)育產(chǎn)生。原腸胚形成的中間階段涉及形成定形內(nèi)胚層。
[0006] 到原腸胚形成結(jié)束時，內(nèi)胚層分裂成了前、中、后三個區(qū)域，可通過檢測一組獨特 標記內(nèi)胚層這三個區(qū)域的因子的表達水平來識別這些區(qū)域。例如，HHEX和S0X2是內(nèi)胚層 前區(qū)的獨特標記物；而CDX1、CDX2和CDX4是內(nèi)胚層后區(qū)的獨特標記物。
[0007] 內(nèi)胚層組織迀移使內(nèi)胚層與不同的中胚層組織緊密靠近，從而有助于腸管分區(qū)。 腸管分區(qū)在多種分泌因子例如FGF、WNT、TGF-e、視黃酸（RA)、BMP配體和它們的拮抗物的 作用下實現(xiàn)。例如，F(xiàn)GF4和BMP促進預定后腸內(nèi)胚層中的CDX2表達并阻遏前基因HHEX和 S0X2 的表達（2000 Development，127 :1563-1567)。還證明了 WNT 信號轉(zhuǎn)導與 FGF 信號轉(zhuǎn) 導并存，能夠刺激后腸發(fā)育并控制前腸命運（2007 Development，134:2207-2217)。最后， 間充質(zhì)分泌的視黃酸調(diào)節(jié)前腸與后腸的邊界（2002 Curr Biol，12:1215-1220)。
[0008] 可利用特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達水平來判斷組織的種類。在定形內(nèi)胚層轉(zhuǎn)化為原腸 管期間，腸管在大范圍內(nèi)逐漸分區(qū)，形成多個區(qū)域。技術人員可通過識別這些區(qū)域的有限基 因表達模式，在分子水平上觀察到這些區(qū)域。腸管中分區(qū)的胰腺域顯示出roxi有極高表 達，但⑶X2和S0X2的表達卻非常低。PDX1、NKX6. 1、PTF1A和NKX2. 2在胰腺組織內(nèi)高度表 達，⑶X2在腸組織內(nèi)高度表達。
[0009] 胰腺形成源于定形內(nèi)胚層分化成胰腺內(nèi)胚層。背側(cè)和腹側(cè)胰腺域衍生自前腸上皮 組織。前腸還會分化成食道、氣管、肺、甲狀腺、胃、肝和膽管系統(tǒng)。
[0010] 胰腺內(nèi)胚層細胞會表達胰十二指腸同源盒基因roxi。沒有roxi時，胰腺在形成腹 胰芽和背胰芽后便不再發(fā)育。因而，PDX1表達是胰腺器官形成中至關重要的一步。成熟胰 腺由胰腺內(nèi)胚層分化產(chǎn)生的外分泌組織和內(nèi)分泌組織構(gòu)成。
[0011] D'Amour等人描述了向人胚胎干細胞的培養(yǎng)基中加入高濃度活化素和少量血 清，由此制得源于人胚胎干細胞的定形內(nèi)胚層的富集培養(yǎng)物（Nature Biotechnology 2005,23 :1534-1541 ;美國專利7,704,738)。據(jù)報道，在把這些定形內(nèi)胚層細胞移植到 小鼠的腎包膜下之后，這些細胞會分化成具有內(nèi)胚層組織特征的更成熟細胞（美國專利 7, 704, 738)。在添加FGF10和視黃酸后，這些衍生自人胚胎干細胞的定形內(nèi)胚層細胞還可 進一步分化成H)X1陽性細胞（美國專利申請公布2005/0266554)。接下來將這些胰腺前體 細胞移植到免疫缺陷小鼠的脂肪墊中，在三至四個月的成熟期后，便得到了功能性胰腺內(nèi) 分泌細胞（美國專利7, 993, 920和美國專利7, 534, 608)。
[0012] Fisk等人報道了 一種由人胚胎干細胞產(chǎn)生胰島細胞的體系（美國專利 7, 033, 831)。在這種情況下，分化途徑分三個階段。首先使用丁酸鈉和活化素A的組合， 使人胚胎干細胞分化成內(nèi)胚層（美國專利7, 326, 572)。然后將這些細胞與結(jié)合了 EGF或 細胞素的BMP拮抗物（如頭蛋白（Noggin)) -起培養(yǎng)，得到H)X1陽性細胞。用煙酰胺 誘導終末分化。
[0013] -直以來，技術人員還使用小分子抑制劑來誘導胰腺內(nèi)分泌前體細胞產(chǎn)生。例 如，已使用TGF-0受體和BMP受體的小分子抑制劑（Development 2011，138 :861-871 ; Diabetes 2011,60:239-247)來顯著增加胰腺內(nèi)分泌細胞的數(shù)量。另外，還使用小分子活 化劑來生成定形內(nèi)胚層細胞或胰腺前體細胞（Curr Opin Cell Biol 2009,21:727-732; Nature Chem Biol2009,5:258-265)。
[0014] HB9 (也稱為H1XB9和MNX1)是一種在胰腺發(fā)育（從胚胎期大約第八天開始）早 期表達的bHLH轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白。HB9也在脊索和脊髓中表達。在胚胎期的第十天半左 右，HB9在胰腺上皮中表達H)X1和NKX6. 1的細胞內(nèi)瞬時表達，水平達到峰值。HB9表達 在第十二天半左右開始衰退，且在胰腺發(fā)育后期，只局限于0細胞內(nèi)。H1XB9無效突變純 合的小鼠未能發(fā)育出胰腺背葉（Nat Genet 23:67-70,1999 ;Nat Genet 23:71-75，1999)〇 HB9-/-P -細胞只表達低濃度的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT2和NKX6. 1。此外，HB9-/-胰腺顯示 胰島素陽性細胞數(shù)目明顯減少，但這種細胞數(shù)目減少并未顯著影響其他胰腺激素的表達水 平。時序控制HB9對于0細胞正常發(fā)并具有正常功能是至關重要的。雖然我們不太清楚 有哪些因子調(diào)節(jié)HB9在0細胞中的表達，但近期用斑馬魚作的研究揭示，視黃酸可能對HB9 表達有正向調(diào)節(jié)作用（Development，138,4597-4608, 2011)。
[0015] 四碘甲狀腺原氨酸（"T4"）和三碘甲狀腺原氨酸（"T3"），它們是由甲狀腺分泌 的基于酪氨酸的激素，主要負責調(diào)節(jié)機體代謝。血液循環(huán)中的甲狀腺激素大多為T4, T4的 半衰期比T3長。釋放入血的T4和T3的比例大約為20比1。T4在細胞中會被脫碘酶轉(zhuǎn)化 為活性較強的T3 (T3的活性是T4的三至四倍）。
[0016]T3隨后結(jié)合到甲狀腺激素受體TRal和TRP1(統(tǒng)稱TR)上。甲狀腺激素受體 (TR)是一種核激素受體，能與類視色素X受體結(jié)合，形成異源二聚體。沒有配體時，這種異 源二聚體便結(jié)合到甲狀腺應答元件（TRE)上，充當轉(zhuǎn)錄抑制子。T3結(jié)合到TR減輕了 TRE依 賴性基因所受抑制，隨后活化各種靶基因表達。雖然多項研究的結(jié)果已揭示T3能夠增進0 細胞增殖、減少細胞凋亡并促進胰島素分泌，但目前仍不明確T3在細胞分化過程中所起的 作用。
[0017] 轉(zhuǎn)化生長因子0 (TGF-0)是參與多種生物過程的一大家族多效性細胞因子的成 員，這些生物過程包括控制細胞生長、分化和迀移，維持細胞活性，促進細胞纖維化，和促進 細胞發(fā)育命運的特化。TGF-0超家族的成員利用由II型受體和I型受體構(gòu)成的受體復合 物傳導信號。TGF-B配體（例如活化素和GDF(生長分化因子））將II型受體與I型受體拉 到一起形成復合物。該復合物中的II型受體隨后磷酸化I型受體，使I型受體活化。哺乳 動物體內(nèi)有五種11型受體，分別為1'01?-11)(^1?-11)(^1?-118、81〇^-11和41〇^-11 ;和七 種I型受體（ALK1到ALK7)。活化素和相關配體利用ActR-II與ALK4或ALK5的組合，或 ActR-IIB與ALK4或ALK5的組合來傳導信號；BMP利用ALK2、ALK3和ALK6與ActR-II的組 合，ALK2、ALK3 和 ALK6 與 ActR-IIB 的組合，或 ALK2、ALK3 和 ALK6 與 BMPR-II 的組合來傳 導信號。AMH利用AMHR-II與ALK6的復合物來傳導信號；另外，最近的研究結(jié)果已顯示，節(jié) 點利用ActR-IIB與ALK7的復合物來傳導信號（Cell. 2003,113(6) :685-700)。在TGF-B配 體結(jié)合到適當?shù)氖荏w之后，接下來出現(xiàn)的信號就主要靠活化Smad復合物傳遞到細胞核。在 活化Smad復合物時，I型受體使由受體調(diào)節(jié)的Smad亞家族的成員磷酸化。磷酸化使這些 成員活化，一旦活化，這些成員就能與常見的中介體Smad(即Smad4)形成復合物。Smad 1、 Smad 5、Smad 8 是 ALK 1、ALK 2、ALK 3、ALK 6 的底物，Smad 2 和 Smad 3 是 ALK 4、ALK 5、 ALK 7的底物（FASEB J 13:2105-2124)?；罨蟮腟mad復合物在細胞核中蓄積，直接參與 通常和其他特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子相關聯(lián)的靶基因轉(zhuǎn)錄。研究人員研制出了能選擇性抑 制TGF-P受體的化合物，并已將它們用于治療應用，另外，已在對各種干細胞群重新編程 且誘導其分化的背景下，使用了這些化合物來調(diào)控細胞命運。具體地，先前已使用ALK5抑 制劑來引導胚胎干細胞分化為內(nèi)分泌細胞（Diabetes，2011，60(1) :239-47)。
[0018] 一般來講，使祖細胞分化為功能性P細胞的過程涉及多個階段。迄今為止人們已 認識到，要在體外定向引導人胚胎干細胞（"hES"）經(jīng)歷多階段逐步形成與0細胞類似的 細胞頗為困難，另外，由人胚胎干細胞產(chǎn)生功能性0細胞也是相當繁瑣的過程。在使祖細 胞分化的過程中，每個步驟面臨的難題各不相同。雖然已在由祖細胞例如人多功能干細胞 產(chǎn)生胰腺細胞的方案方面取得進展，但仍需要繼續(xù)開發(fā)用于產(chǎn)生功能性內(nèi)分泌細胞（尤其 是功能性0細胞）的方案。
【附圖說明】
[0019] 圖1A至圖1C繪出按實例1概述的步驟分化為胰腺內(nèi)胚層/內(nèi)分泌前體細胞的人 胚胎干細胞系H1的細胞中以下基因表達的實時PCR分析數(shù)據(jù)，這些基因分別是：PDX1 (圖 1A)，NKX6. 1 (圖 IB)，HB9 (圖 1C)。
[0020] 圖2A至圖2C示出按實例1概述的步驟分化為胰腺內(nèi)胚層/內(nèi)分泌前體細胞的人 胚胎干細胞系H1的以下基因的FACS分析結(jié)果，這些基因分別是：PDX1 (圖2A)，NKX6. 1 (圖 2B)，HB9 (圖 2C)。
[0021] 圖3A和圖3B示出在對細胞中的NXK6. 1、胰島素或HB9行免疫染色后采集的細胞 圖像。這些細胞首先按實例1概述的步驟分化為胰腺內(nèi)胚層/內(nèi)分泌前體細胞，再行免疫 染色。圖3A的左圖示出對NKX6. 1行免疫染色后的細胞圖像，右圖示出對胰島素行免疫染 色后的細胞圖像。圖3B的左圖示出對HB9行免疫染色后的細胞圖像，右圖示出對胰島素行 免疫染色后的細胞圖像。
[0022] 圖4A、圖4B和圖4C繪出按實例2概述的步驟分化到第四階段再到第六階段的人 胚胎干細胞系H1，在分化過程的第四階段第三天（圖4A)、第五階段第四天（圖4B)和第六 階段第三天（圖4C)，其中roXl、NKX6. 1和HB9基因表達百分比的FACS數(shù)據(jù)。
[0023] 圖5A為按實例2概述的步驟分化的細胞在分化第二階段到第六階段，其中的 HB9mRNA表達水平與人類胰島中HB9mRNA表達水平的對比圖。
[0024] 圖5B繪出在對按實例2概述的步驟分化到第四階段第三天的細胞行NXK6. 1和 HB9免疫染色后，采集的細胞圖像：左圖為對NXK6. 1行免疫染色后的圖像，右圖為對HB9行 免疫染色后的圖像。
[0025] 圖6A至圖6J繪出按實例2概述的步驟分化到第四階段，接著只在第四階段、或 在第四階段到第五階段、或在第四階段到第六階段接受處理的人胚胎干細胞系H1的細 胞中以下基因表達的實時PCR分析數(shù)據(jù)。圖6A至圖6J依次繪出以下基因的表達數(shù)據(jù)： NKX6. 1 (圖6A)，PDX1 (圖6B)，NKX2. 2 (圖6C)，胰高血糖素基因（圖6D)，胰島素基因（圖 6E)，生長激素抑制素基因（圖6F)，⑶X2(圖6G)，白蛋白基因（圖6H)，胃泌素基因（圖61)， S0X2 (圖 6J)。
[0026] 圖7A示出對按實例2概述的步驟分化的對照培養(yǎng)物行免疫染色的結(jié)果，圖7B示 出對按實例2概述的步驟分化的經(jīng)處理培養(yǎng)物行免疫染色的結(jié)果。對第六階段的對照培養(yǎng) 物和經(jīng)處理培養(yǎng)物行免疫染色的結(jié)果顯示，與第六階段的對照組（圖7A)相比，T3處理組 (圖7B)中的HB9陽性細胞的數(shù)量顯著增加。
[0027] 圖8A和圖8B繪出對按實例3概述的步驟分化到第六階段的細胞，在分化過程第 六階段第七天，行NKX6. 1和HB9免疫染色得到的結(jié)果。圖8C繪出按實例3概述的步驟分 化到第六階段的人胚胎干細胞系H1的細胞中HB9表達的實時PCR分析數(shù)據(jù)。
[0028] 圖9A和圖9B繪出按實例3概述的步驟分化到第六階段的人胚胎干細胞系H1的 細胞，分別在分化過程第六階段的第五天和第十五天，其中HB9的FACS數(shù)據(jù)。
[0029] 圖10A至圖10E繪出對根據(jù)實例4概述的方案分化的細胞，在分化過程第六階段 第六天，行NKX6. 1和HB9免疫染色得到的結(jié)果。T3以劑量依賴的方式顯著增加NKX6. 1陽 性胰腺內(nèi)胚層前體細胞中HB9陽性細胞的數(shù)量。
[0030] 圖11A至圖11L繪出按實例4概述的步驟分化到第六階段的人胚胎干細胞系H1 的細胞中以下基因表達的實時PCR分析數(shù)據(jù)，這些基因分別是：S0X2 (圖11A)，NKX6. 1 (圖 11B)，NKX2. 2(圖 11C)，胃泌素基因（圖 11D)，PDX1 (圖 11E)，NGN3(圖 11F)，PAX6(圖 11G)， PAX4(圖11H)，胰島素基因（圖111)，胰高血糖素基因（圖11J)，生長激素釋放肽基因（圖 11K)，生長激素抑制素基因（圖11L)。
【具體實施方式】
[0031] 結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的以下【具體實施方式】，能更好地理解【具體實施方式】。提供附 圖是出于舉例說明本發(fā)明的某些實施例的目的。然而，本發(fā)明并不限于示出的精確布置方 式、實例和手段。為了清晰說明本公開內(nèi)容，以非限制性方式將本發(fā)明的【具體實施方式】分成 描述或闡明本發(fā)明的某些特征、實施例或應用方式的多個小節(jié)。
[0032] 本發(fā)明涉及使用某些甲狀腺激素或其類似物、與ALK5(TGFP I型受體激酶）抑制 劑，以特定培養(yǎng)順序產(chǎn)生對于NKX6. 1、H)X1和HB9呈陽性的胰腺內(nèi)胚層細胞。因此，本發(fā)明 提供了一種體外細胞培養(yǎng)物，其用于使衍生自多能干細胞的細胞分化成表達0細胞譜系 的特征性標志物并表達NKX6. 1、H)X1和HB9的細胞。本發(fā)明還提供了利用體外細胞培養(yǎng)物 獲得此類細胞的方法。在某些實施例中，本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)：分化細胞中包含的T3、T4 或它們的類似物在細胞分化中充當HB9蛋白質(zhì)表達的誘導物，以有利于向0細胞分化。HB9 在第三階段和第四階段都不以蛋白質(zhì)水平表達。因此，本發(fā)明提供了通過調(diào)控HB9蛋白質(zhì) 表達使干細胞分化的方法。具體地，本發(fā)明提供了通過使用T3、T4或它們的類似物與ALK5 抑制劑，以特定培養(yǎng)順序產(chǎn)生對于NKX6. 1、H)X1和HB9呈陽性的胰腺內(nèi)胚層細胞的方法。
[0033] 定義
[0034] 干細胞是通過其在單細胞水平上既自我更新又分化的能力來定義的未分化細胞。 干細胞可產(chǎn)生子代細胞，包括自我更新祖細胞、非更新祖細胞和終末分化細胞。干細胞的特 征還在于其具備在體外分化成來自多個胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚層）的多種細胞譜系 的功能細胞的能力。干細胞還在移植后產(chǎn)生多種胚層的組織，并且在注射到胚泡內(nèi)之后，促 成基本上至大部分（如果不是所有的話）組織。
[0035] 干細胞根據(jù)其發(fā)育潛能分類。多能干細胞能夠產(chǎn)生所有胚胎細胞類型。
[0036] 分化是未特化的（"未定向的"）或特化不足的細胞獲得特化細胞（例如神經(jīng)細 胞或肌肉細胞）的特征的過程。分化的細胞是已在細胞譜系中占據(jù)更特化的（"定向的"） 位置的細胞。當應用于分化過程時，術語"定向的"是指已經(jīng)在分化途徑中進行到一定程度 的細胞，其中在正常情況下，該細胞將繼續(xù)分化成特定的細胞類型或一個亞群的細胞類型， 并且在正常情況下，不能分化成不同的細胞類型或回復至分化程度更低的細胞類型。"去分 化"指細胞回復到細胞的譜系當中特化（或定向）程度較低的地位的過程。如本文所用， "細胞譜系"限定細胞的遺傳性，即它來自哪些細胞和它能產(chǎn)生什么細胞。細胞譜系將細胞 定位于發(fā)育和分化的遺傳計劃內(nèi)。譜系特異性標記物是指與所關注譜系的細胞的表型明確 地相關聯(lián)的特征，可用來評估未定向細胞向所關注譜系的分化。
[0037] 如本文所用，"標志物"是在所關注的細胞中差異表達的核酸或多肽分子。在該語 境中，差異表達意指與未分化細胞相比針對陽性標志物的升高的水平以及針對陰性標志物 的下降的水平。由于標志物核酸或多肽在所關注細胞中的可檢測水平充分地高于或低于在 其他細胞中的那些，所以可使用本領域已知的多種方法中的任何一種將所關注細胞與其他 細胞鑒別和區(qū)分開來。
[0038] 如本文所用，當在細胞中充分檢測到特定標記物時，細胞"對于該特定標記物是陽 性的"，或是"陽性的"。相似地，當未在細胞中充分檢測到特定標志物時，細胞為該特定標記 物"陰性"，或為該特定標記物"陰性"。具體地，F(xiàn)ACS檢測的陽性閾值通常大于2%，而FACS 檢測的陰性閾值通常小于1%。通常以循環(huán)數(shù)（Ct)小于34判斷PCR檢測為陽性，而通常以 循環(huán)數(shù)大于34. 5判斷PCR檢測為陰性。
[0039] 嘗試著在靜態(tài)體外細胞培養(yǎng)物中將多能干細胞的分化過程復制進功能性胰腺內(nèi) 分泌細胞時，通常將該分化過程視為分多個連續(xù)階段循序進行。具體地，該分化過程常被視 為分六個階段循序進行。在這種分步進行的過程中，"第一階段"是指分化過程的第一步， 多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層細胞的特征性標志物的細胞（下文也稱作"第一階段細 胞。"第二階段"是指分化過程的第二步，表達定形內(nèi)胚層細胞的特征性標志物的細胞分 化為表達腸管細胞的特征性標志物的細胞（下文也稱作"第二階段細胞"）。"第三階段"是 指分化過程的第三步，表達腸管細胞的特征性標志物的細胞分化為表達前腸內(nèi)胚層細胞的 特征性標志物的細胞（下文也稱作"第三階段細胞"）。"第四階段"是指分化過程的第三 步，表達前腸內(nèi)胚層細胞的特征性標志物的細胞分化為表達胰腺前腸前體細胞的特征性標 志物的細胞（下文也稱作"第四階段細胞"）。"第五階段"是指分化過程的第五步，表達胰 腺前腸前體細胞的特征性標志物的細胞分化為表達胰腺內(nèi)胚層細胞和/或胰腺內(nèi)分泌前 體細胞的特征性標志物的細胞（下文統(tǒng)稱為"胰腺內(nèi)胚層/內(nèi)分泌前體細胞"，或是"第五 階段細胞"）。"第六階段"是指分化過程的第六步，表達胰腺內(nèi)胚層/內(nèi)分泌前體細胞的特 征性標志物的細胞分化為表達胰腺內(nèi)分泌細胞的特征性標志物的細胞（下文也稱作"第六 階段細胞"）。
[0040] 然而，應當指出在特定細胞群中并非所