預(yù)測(cè)對(duì)egfr抑制劑的響應(yīng)的制作方法
【專利說(shuō)明】預(yù)測(cè)對(duì)EGFR抑制劑的響應(yīng) 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] -般而言，本發(fā)明涉及與對(duì)EGFR抑制劑的響應(yīng)性有關(guān)的遺傳變異。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 絲氨酸/蘇氨酸激酶LKB1首次是作為家族性癌癥綜合征波伊茨-耶格綜合征 (Peutz-Jegherssyndrome)中突變的基因鑒定的（Hemminkietal.，1998,Nature, 391:184-187)。 隨后，在多種散發(fā)性癌癥（包括多達(dá)30 %的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC))中找到LKB1中的體細(xì)胞突 變（Sanchez-Cespedes, 2007,Oncogene, 26:7825-7832)。LKB1 作為腫瘤阻抑物的分子功能仍然是 未知的。
[0004] 類似地，長(zhǎng)期以來(lái)已經(jīng)將表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)中的突變與許多類型的癌癥 (包括肺）聯(lián)系起來(lái)（Pastorinoetal.，1993,J.Cell.Biochem.Suppl.，17F:237-248) 〇 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多靶向EGFR的藥物，并且在臨床上成功用于治療數(shù)種類型的癌癥，包括 厄洛替尼（Tarceva?，在2004年得到批準(zhǔn)）、吉非替尼（Iressa?，2003年）、帕尼單 抗（Vectibix?, 2006年）和西妥昔單抗（Erbitux?，2004年）。然而，經(jīng)常產(chǎn)生對(duì)這 些治療的繼發(fā)性抗性（Weietal.，2011，AnticancerDrugs, 22:963-970;Bruggerand Thomas, 2012,LungCancer, 77:2-8)。雖然認(rèn)為EGFR的活化性突變（EGFR-Mut+)預(yù)測(cè)對(duì) EGFR靶向性療法的響應(yīng)性，但是它們是不充分的。此外，已經(jīng)觀察到在EGFR突變?nèi)笔聦?duì) EGFR革巴向性療法的響應(yīng)性（PiperdiandPerez-Soler, 2012,Drugs, 72Suppl. 1:11-19)。這 些結(jié)果提示了需要能更好預(yù)測(cè)患者對(duì)EGFR靶向性療法的響應(yīng)的診斷學(xué)。
[0005] 數(shù)個(gè)小組已經(jīng)報(bào)告了活化性EGFR突變和功能喪失性LKB1突變是互相 排他的（盡管這兩者經(jīng)常在肺癌和其它類型的癌癥中觀察到）；也就是說(shuō)，若存 在一種突變，則另一種發(fā)生的可能性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上比突變?cè)诨颊呷后w內(nèi)隨機(jī)分配要 低(Reungwetwattanaetal.,2012,Clin.LungCancer, 13:252-266;Chitaleet al. , 2008,Oncogene, 28:2773-2783；Koivunenetal. , 2008,Br.J.Cancer, 455:245-252 ； Dingetal., 2008,Nature, 455:1069-1075)。這提示了它們可能牽涉相同的分子途徑，并 且一種或另一種的突變足以使此途徑脫調(diào)節(jié)（deregulate)，并且驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 在一些實(shí)施方案中，提供了用于預(yù)測(cè)癌癥是否會(huì)響應(yīng)EGFR抑制劑的方法。在一些 實(shí)施方案中，一種方法包括測(cè)定所述癌癥是否包含LKB1突變，其中所述LKB1突變的存在指 示所述癌癥會(huì)響應(yīng)所述EGFR抑制劑。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，提供了鑒定可能受益于EGFR抑制劑的癌癥患者的方法。在一 些實(shí)施方案中，一種方法包括測(cè)定所述患者的癌癥是否包含LKB1突變，其中所述LKB1突變 的存在指示所述癌癥患者可能會(huì)受益于所述EGFR抑制劑。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，提供了為癌癥患者選擇療法的方法。在一些實(shí)施方案中，一種 方法包括（a)測(cè)定所述患者的癌癥是否包含LKB1突變；并且（b)若所述患者的癌癥包含 LKB1突變，則為所述療法選擇EGFR抑制劑。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，提供了治療哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，一 種方法包括（a)測(cè)定所述癌癥是否包含LKB1突變；并且（b)若所述癌癥包含LKB1突變，則 對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的EGFR抑制劑。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，提供了治療哺乳動(dòng)物中包含LKB1突變的癌癥的方法。在一些 實(shí)施方案中，一種方法包括對(duì)所述具有癌癥的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的EGFR抑制劑。在 一些實(shí)施方案中，在施用所述EGFR抑制劑前，所述癌癥測(cè)定為包含LKB1突變。
[0012] 在本文中描述的任何實(shí)施方案中，所述癌癥可以是實(shí)體瘤。在本文中描述的任何 實(shí)施方案中，所述癌癥可以選自大細(xì)胞癌、類癌癌、神經(jīng)內(nèi)分泌起源的癌癥、頭和頸鱗狀細(xì) 胞癌（HNSCC)、結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、黑素瘤、皮膚癌、平滑肌瘤、胃癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、卵巢 癌、小細(xì)胞肺癌（SCLC)、非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)、胰腺癌、食道癌、胃癌和甲狀腺癌。在本文 中描述的任何實(shí)施方案中，所述癌癥可以選自肺癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、和頭和頸癌。在本 文中描述的任何實(shí)施方案中，所述癌癥可以是選自表2中組織的組織。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，所述LKB1突變包含LKB1多核苷酸中的變異。在一些實(shí)施方 案中，所述LKB1多核苷酸中的變異在LKB1多核苷酸的編碼序列中。在一些實(shí)施方案中，所 述LKB1多核苷酸中的變異包含至少一種選自插入、刪除、倒位、和替代的變異。在一些實(shí)施 方案中，所述LKB1多核苷酸中的變異導(dǎo)致LKB1編碼序列中的移碼。在一些實(shí)施方案中，所 述LKB1多核苷酸中的變異是選自表1的核苷酸位置處的核苷酸變異，其導(dǎo)致（a)水平顯著 降低或缺乏的LKB1蛋白質(zhì)和/或（b)活性顯著降低的LKB1蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一些實(shí)施方 案中，所述LKB1多核苷酸中的變異是選自表1的核苷酸變化。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，所述LKB1多核苷酸中的變異導(dǎo)致LKB1多肽中的變異。在一 些實(shí)施方案中，所述LKB1多肽中的變異選自插入、替代、刪除、和截短。在一些實(shí)施方案中， 所述LKB1多肽中的至少一處變異是選自表1的氨基酸位置處的氨基酸變異，其導(dǎo)致（a)水 平顯著降低或缺乏的LKB1蛋白質(zhì)和/或（b)活性顯著降低的LKB1蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一些 實(shí)施方案中，所述LKB1多肽中的至少一處變異是選自表1的氨基酸變化。
[0015] 在本文中描述的任何實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物可以是人。
[0016] 在本文中描述的任何實(shí)施方案中，所述EGFR抑制劑可以是結(jié)合EGFR的抗體。在 一些實(shí)施方案中，所述EGFR抑制劑選自西妥昔單抗、帕尼單抗、DL1If、和GA201。
[0017] 在本文中描述的任何實(shí)施方案中，所述EGFR抑制劑可以是小分子。在一些實(shí)施方 案中，所述EGFR抑制劑選自厄洛替尼或吉非替尼。
[0018] 這些和其它實(shí)施方案在下面的書面描述中有描述。
[0019] 附圖簡(jiǎn)述
[0020] 圖 1 顯示了與NMPP1、EGF、NMPP1+EGF、NMPP1+EGF+ 厄洛替尼（Tarceva?)、或 NMPP1+FGF7+厄洛替尼(Taffie鄉(xiāng)⑩)一起溫育的Lkblwt/mLkbl 小鼠胚胎無(wú)間充質(zhì)肺組 織外植體的生長(zhǎng)和分支，如實(shí)施例2中描述的。
[0021] 圖 2 顯示了與NMPP1、EGF、NMPP1+EGF、或NMPP1+EGF+ 厄洛替尼(Tarceva?)-起 溫育的Lkblwt/mLkblM(;/M(：小鼠胚胎整裝（wholemount)肺組織外植體的生長(zhǎng)和分支，如 實(shí)施例2中描述的。
[0022] 圖3A-B顯示了⑷在NMPP1存在或缺失下LKBlwt/lPLKB1 肺中的EGFR水平， 和⑶在NMPP1存在下在有或無(wú)與EGF-起溫育10分鐘的情況中LKBlwt/wlPLKB1 肺 中的EGFR酪氨酸磷酸化，如實(shí)施例2中描述的。
[0023] 圖4顯示了與NMPP1、EGF、和NMPP1+EGF-起溫育的LKB1MG/MG胰腺外植體中囊腫 表型的形成，如實(shí)施例2中描述的。
[0024] 圖5顯示了與EGF或EGF和NMPPI-起溫育的Lkblwt/wlPLkb1 MG/MG胰腺外植體中 囊腫表型的形成，如實(shí)施例2中描述的。
[0025] 圖6顯示了與EGF和NMPPI，或與EGF、NMPPI、和厄洛替尼(Tarceva?)-起溫育的 Lkbrt/w4P LkblMW胰腺外植體中囊腫表型的形成，如實(shí)施例2中描述的。
[0026] 發(fā)明詳述
[0027]I?定義
[0028] 出于解讀本說(shuō)明書的目的，會(huì)應(yīng)用下述定義，并且只要時(shí)機(jī)合適，以單數(shù)使用的術(shù) 語(yǔ)還會(huì)包括復(fù)數(shù)，且反之亦然。在下文列出的任何定義與通過(guò)提及收入本文中的任何文件 矛盾的情況中，會(huì)以下文列出的定義為準(zhǔn)。
[0029] 除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)、符號(hào)和其它科學(xué)術(shù)語(yǔ)意圖具有本發(fā) 明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的意義。在一些情況中，為了清楚和/或?yàn)榱朔奖闾峒?，?本文中定義了具有通常理解意義的術(shù)語(yǔ)，并且本文中納入此類定義不應(yīng)必然解釋為代表與 本領(lǐng)域中的一般理解的實(shí)質(zhì)性差異。本文中描述或提及的技術(shù)和規(guī)程是本領(lǐng)域技術(shù)人員一 般充分了解并且使用常規(guī)方法，通常采用的。在適當(dāng)時(shí)，一般依照制造商限定的方案和/或 參數(shù)實(shí)施牽涉使用商品化試劑盒和試劑的規(guī)程，除非另有注釋。
[0030] 在描述本組合物和方法前，要理解本發(fā)明不限于描述的特定方法、方案、細(xì)胞系、 動(dòng)物種或?qū)?、?gòu)建體、和試劑，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然可以變化。還要理解本文中使用的術(shù)語(yǔ)僅為了 描述具體的實(shí)施方案，而并不意圖限制本發(fā)明的范圍，其僅會(huì)以所附權(quán)利要求書限制。
[0031] 必須注意，如本文中和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"所 述/該"包括復(fù)數(shù)，除非上下文另有明確敘述。
[0032] 貫穿本說(shuō)明書和權(quán)利要求書，詞語(yǔ)"包含"或變型（諸如"包括"）會(huì)理解為暗示包 括敘述的整數(shù)或整數(shù)組，但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。
[0033] 術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"在以單數(shù)或復(fù)數(shù)使用時(shí)一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧 核糖核苷酸，其可以是未修飾的RNA或DNA或經(jīng)修飾的RNA或DNA。如此，例如，本文中限定 的多核苷酸包括但不限于單鏈和雙鏈DNA、包含單鏈和雙鏈區(qū)的DNA、單鏈和雙鏈RNA、和包 含單鏈和雙鏈區(qū)的RNA、包含DNA和RNA的雜合分子，其可以是單鏈或更通常雙鏈或者包含 單鏈和雙鏈區(qū)。另外，如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"指包含RNA或DNA或RNA和DNA兩 者的三鏈區(qū)。此類區(qū)域中的鏈可以來(lái)自相同分子或來(lái)自不同分子。區(qū)域可以包含全部的一 個(gè)或多個(gè)分子，但是更通常僅牽涉一些分子的區(qū)域。三股螺旋區(qū)的分子之一常常是寡核苷 酸。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"明確包括cDNA。該術(shù)語(yǔ)包括含有一種或多種經(jīng)修飾的堿基的DNA(包 括cDNA)和RNA。如此，具有出于穩(wěn)定性或出于其它原因而修飾的主鏈的DNA或RNA是"多 核苷酸"，就像該術(shù)語(yǔ)在本文中的意圖一樣。此外，如本文中定義的，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"內(nèi)包 括包含罕見(jiàn)堿基（諸如肌苷）或經(jīng)修飾的堿基（諸如氚化堿基）的DNA或RNA。一般地，術(shù) 語(yǔ)"多核苷酸"涵蓋未修飾的多核苷酸的所有化學(xué)、酶促和/或代謝修飾形式，及病毒和細(xì) 胞（包括簡(jiǎn)單和復(fù)雜細(xì)胞）特征性的DNA和RNA的化學(xué)形式。
[0034] 術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"指相對(duì)較短的多核苷酸，包括但不限于單鏈脫氧核糖核苷酸、單 鏈或雙鏈核糖核苷酸、RNA:DNA雜合物和雙鏈DNA。常常通過(guò)化學(xué)方法（例如使用商品化的 自動(dòng)化寡核苷酸合成儀）合成寡核苷酸（諸如單鏈DNA探針寡核苷酸）。然而，可以通過(guò)多 種其它方法（包括體外重組DNA介導(dǎo)的技術(shù)和通過(guò)在細(xì)胞和生物體中表達(dá)DNA)生成寡核 苷酸。
[0035] 術(shù)語(yǔ)"引物"指能夠與核酸雜交并且容許互補(bǔ)核酸聚合（一般通過(guò)提供游離的 3' -0H基團(tuán)）的單鏈多核苷酸。
[0036] "HER受體"是一種受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，其屬于HER受體家族，并且包括 EGFR(ErbBl，HER1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)受體。HER受體一般會(huì)包 含胞外域（其可結(jié)合ffiR配體和/或與另一個(gè)ffiR受體分子二聚化）；親脂性跨膜域；保守 的胞內(nèi)酪氨酸激酶域；和含有數(shù)個(gè)能磷酸化的酪氨酸殘基的羧基端信號(hào)傳導(dǎo)域。ffiR受體 可以是天然存在的（"天然序列受體或其變體。優(yōu)選地，ffiR受體是天然序列人ffiR 受體。
[0037] "HER途徑"指由HER受體家族介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。
[0038] 術(shù)語(yǔ)1洸81"、"冊(cè)1?1"、"表皮生長(zhǎng)因子受體"和16?1?"在本文中可互換使用， 并且指例如如Carpenteretal.，Ann.Rev.Biochem. 56:881-914(1987)中披露的EGFR， 包括其天然存在的突變體形式（例如如Ullrichetal.，Nature(1984) 309:418-425和 Humphreyetal.，PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的刪除突變體EGFR)，及其變體，諸 如EGFRvIII。EGFR變體還包括刪除、替代和插入變體，例如那些記載于Lynchetal(New EnglandJournalofMedicine2004,350:2129),Paezetal(Science2004,304:1497), 及Paoetal(PNAS2004,101:13306)的。
[0039] 在本文中，"EGFR胞外域"或"EGFRE⑶"指EGFR中在細(xì)胞外部（錨定于細(xì)胞膜或在 循環(huán)中）的域，包括其片段。在一些實(shí)施方案中，EGFR的胞外域可以包含四種域："域I"（氨 基酸殘基約1-158)、"域II"（氨基酸殘基159-336)、"域III"（氨基酸殘基337-470)、和 "域IV"（氨基酸殘基471-645)，其中邊界是大概的，并且可以相差約1-3個(gè)氨基酸。
[0040] "磷酸化"指對(duì)蛋白質(zhì)（諸如EGFR受體）或其底物添加一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)。
[0041] 術(shù)語(yǔ)"絲氨酸/蘇氨酸激酶11"、"STK11"、"肝激酶B1"、和"LKB1"可互換使用，并 且指來(lái)自任何脊椎動(dòng)物來(lái)源（包括哺乳動(dòng)物，諸如靈長(zhǎng)類（例如人）和嚙齒類（例如小鼠和 大鼠））的任何天然的LKB1蛋白質(zhì)、編碼序列、或基因，除非另有指示。該術(shù)語(yǔ)涵蓋"全長(zhǎng)" 未加工LKB1及源自天然加工的任何形式的LKB1。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋LKB1的天然存在變體，例如 剪接變體或等位變體。一種例示性人LKB1蛋白質(zhì)的序列以Swiss-Prot登錄號(hào)No.Q15831. 1 顯示。一種例示性人LKB1編碼序列的序列以GenBank登錄號(hào)No.NM_000455. 4顯示。例示 性遺傳信息（包括基因位置、序列、和內(nèi)含子/外顯子邊界）以NCBI基因ID6794顯示。 SEQIDN0:1中顯示了一種非限制性例示性LKB1編碼序列。