一種利用銅螯合磁珠分離銅蛋白質組的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白質化學領域技術領域，具體的說是一種利用銅螯合磁珠分離銅蛋白質組的方法。
【背景技術】
[0002]全國污染狀況調查公報顯示，全國土壤污染總超標率為16.1%，其中重金屬污染占80%以上。土壤中的重金屬大多數(shù)容易在植物體內積累，并通過食物鏈危害人類的健康。另一方面，由于蛋白質的半胱氨酸、甲硫氨酸和組氨酸殘基對二價金屬離子有很高的親和力，因此細胞內的過量的重金屬可能干擾必需金屬元素與蛋白的結合，造成蛋白變性或酶失活，干擾正常的代謝過程。
[0003]蛋白質組學技術目前已經(jīng)成為功能基因組領域一個重要的研究手段。一個蛋白質組(一個基因組或一個細胞、組織內所表達的所有蛋白質)中所有具有金屬結合位點的蛋白稱為金屬蛋白質組(Metal1proteome)。從生物組織或細胞的全套蛋白質中找到的金屬位點會保留生物學的關聯(lián)性，這對于了解細胞內金屬元素的動態(tài)平衡具有重要意義。
[0004]固定化金屬親和層析(IMAC)與質譜偶聯(lián)是鑒定金屬結合蛋白的重要技術。IMAC是利用蛋白中的一些氨基酸，如半胱氨酸、組氨酸和色氨酸等，能與固體柱上吸附的金屬陽離子(如Zn2+，Cu2+，Ni2+和Co2+等)發(fā)生結合的特性，來分離具有該金屬結合位點的蛋白質。但IMAC需要進行裝柱、洗脫等多個過程，試驗程序麻煩。
[0005]磁珠是今年來發(fā)展起來并已廣泛應用于醫(yī)學生物學領域的一種多功能試劑，它由磁性內核和核外包裹的高分子外殼兩部分組成，利用磁核對外磁場的響應，可以將磁珠從周圍介質中迅速分離出來。Li等(2007)以納米粒子為基質，用氮川三乙酸(NTA)包覆納米粒子作為親和絡合劑，來提純帶有組氨酸標簽的蛋白質，發(fā)現(xiàn)純化效果顯著優(yōu)于IMAC，并且這種方法可省去裝柱的繁瑣程序。但該方法的不足之處是，NTA毒性很大，且價格不便宜，使用范圍受到限制。亞氨基二乙酸(IDA)是一種比NTA螯合能力更強、應用更為廣泛的金屬螯合劑，并且IDA價格便宜，不同基質偶聯(lián)的IDA-Ni在天然或變性條件下都能較好地純化HIS標簽重組蛋白。
[0006]由于自然狀態(tài)下絕大多數(shù)蛋白的金屬結合位點存在于分子內部，因此我們很難通過固定金屬法來分離到完整的金屬蛋白組，但是之前對金屬結合蛋白的研究文獻中均未對此加以考慮。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種利用銅螯合磁珠分離銅蛋白質組的方法，利用銅螯合磁珠來分離變性條件下的金屬蛋白質組，大大簡化了程序，提高了金屬蛋白的獲得效率，建立了一套適合于過量重金屬處理條件下組織或細胞中金屬蛋白質組的分離方法。
[0008]一種利用銅螯合磁珠分離銅蛋白質組的方法，包括以下步驟: (1)、取生物組織或細胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均勻后，低溫離心，獲得變性的蛋白溶液；研磨后生物組織或細胞與蛋白提取液的固液比為:1:4 ;所述蛋白提取液的組成成份為:每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸鈉，pH 7.8, 300mmol/L氯化鈉，質量百分比為0.1-1%的Triton X-100, 8mol/L尿素，余量為水；
(2)、按照銅螯合磁珠與變性的蛋白溶液體積比為1:1的比例，將銅螯合磁珠(濃度為
10mg/ml)與(I)獲得的變性的蛋白溶液進行混合，置于25°C -37下孵育15_30min，得到磁珠蛋白混合溶液；
(3)、在低溫條件下，在磁珠蛋白混合溶液中加入其體積I倍的緩沖液I混懸5分鐘后，在外加磁場下倒去一半的上清液；然后再添加緩沖液1，在外加磁場下倒去一半的上清液；重復4-5次，去除變性條件及非特異性的銅結合蛋白，得到混合液A ;在混合液A中加入其體積I倍的緩沖液2，將所有的特異性銅結合蛋白，即銅蛋白質組分離出來，外加磁場下收集銅蛋白質組；
所述緩沖液I的組成成分為:每升緩沖液I中含50 mmol/L磷酸鈉，pH 6.5，300mmol/L氯化鈉和5_20 m mol/L咪卩坐，余量為水；
所述緩沖液2的組成成分為:每升緩沖液2中含50 mmol/L磷酸鈉，pH 5.8，300mmol/L氯化鈉I和30-60 m mol/L咪卩坐，余量為水。
[0009]步驟(I)中所述低溫離心，4°C低溫下，15000g離心30min。
[0010]步驟(2)所述銅螯合磁珠與(I)獲得的變性的蛋白溶液進行混合，置于37°C下孵育 30min。
[0011]所述步驟(3)分5次加入緩沖液1，即每次加入I倍體積的緩沖液1，混懸5分鐘后，在外加磁場下倒去I半的上清液，逐步去除變性條件，讓結合到磁珠表面的銅結合蛋白緩慢復性，同時將非特異性的銅結合蛋白去除。
[0012]步驟(3 )所述低溫條件，為4-5 0C。
[0013]有益效果是:
本發(fā)明提供的銅結合蛋白的分離方法，程序簡單，大大提高了銅結合蛋白的獲得效率，建立了一套適合于過量重金屬處理條件下生物組織或細胞中金屬蛋白質組的分離技術。本發(fā)明中的變性條件能夠使蛋白多肽鏈處于伸展狀態(tài)，更利于與固定金屬離子的親和吸附作用，而在去除變性條件的蛋白質復性過程由于在磁珠表面進行，避免了變性蛋白的聚集沉淀，而且形成的配合物更穩(wěn)定，保證分離到盡可能多的銅結合蛋白。
【附圖說明】
[0014]圖1是水稻銅結合蛋白的對照2-DE圖譜；
圖2是水稻銅結合蛋白的2-DE圖譜；
圖3是鑒定到銅結合蛋白(蛋白二硫鍵異構酶)的質譜圖；
圖中標記:con為對照；cu為銅。
【具體實施方式】
[0015]一種利用銅螯合磁珠分離銅蛋白質組的方法，包括以下步驟:
(1)、取生物組織或細胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均勻后，低溫離心，獲得變性的蛋白溶液；蛋白提取液的加入量為，研磨后生物組織或細胞與蛋白提取液的固液比為:1:4;所述蛋白提取液的組成成份為:每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸鈉，pH7.8，300mmol/L氯化鈉，質量百分比為0.1-1%的Triton X-100, 8mol/L尿素，余量為水；
(2)、按照濃度為10mg/ml的銅螯合磁珠與變性的蛋白溶液體積比為1:1的比例，將濃度為10 mg/ml的銅螯合磁珠與(I)獲得的變性的蛋白溶液進行混合，置于25°C -37下孵育15-30min，得到磁珠蛋白混合溶液；
(3)、在低溫條件下，在磁珠蛋白混合溶液中加入其體積I倍的緩沖液I混懸5分鐘后，在外加磁場下倒去一半的上清液；然后再添加緩沖液1，在外加磁場下倒去一半的上清液；重復4-5次，去除變性條件及非特異性的銅結合蛋白，得到混合液A ;在混合液A中加入其體積I倍的緩沖液2，將所有的特異性銅結合蛋白，即銅蛋白質組分離出來，外加磁場下收集銅蛋白質組；
所述緩沖液I的組成成分為:每升緩沖液I中含50 mmol/L磷酸鈉，pH 6.5，300mmol/L氯化鈉和5_20 m mol/L咪卩坐，余量為水；
所述緩沖液2的組成成分為:每升緩沖液2中含50 mmol/L磷酸鈉，pH 5.8，300mmol/L氯化鈉和30-60 m mol/L咪卩坐，余量為水。
[0016]步驟(I)中所述低溫離心，4°C低溫下，15000g離心30min。
[0017]步驟(2)所述銅螯合磁珠與(I)獲得的變性的蛋白溶液進行混合，置于37°C下孵育 30min。
[0018]所述步驟(3)分5次加入緩沖液1，即每次加入I倍體積的緩沖液1，混懸5分鐘后，在外加磁場下倒去I半的上清液，逐步去除變性條件，讓結合到磁珠表面的銅結合蛋白緩慢復性，同時將非特異性的銅結合蛋白去除。
[0019]步驟(3 )所述低溫條件，為4-5 0C。
[0020]本發(fā)明中提到的銅螯合磁珠中Cu2+也可以替換為Co 2+\Zn2+\Cd2+等其他二價金屬離子，從而獲得相應的金屬結合蛋白。以下實施例用于解釋說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的保護范圍有任何形式的限定。
[0021]實施例1
一、表面螯合金屬銅的磁珠的制備
(I)羥基磁珠的活化:將羥基磁珠(洛陽，惠兒納米)中加入5M氫氧化鈉溶液，使pH值達到12-14，反應后得到活化充分的磁珠(濃度為10 mg/ml)。
[0022](2)環(huán)氧化:(1)得到的活化羥基磁珠中加入二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和5M氫氧化鈉溶液(磁珠、環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液體積比為1:2:1:4)，于60°C下緩慢攪拌過夜后洗至中性，使其連接上環(huán)氧基，得到環(huán)氧化磁珠。
[0023](3)螯合基IDA偶聯(lián):(2)得到的環(huán)氧化磁珠(10 mg/ml)，每毫升中加入I倍體積的IDA(10%，用IM氫氧化鈉調至pH 8)，緩慢攪拌10小時，洗至中性后吸干，得到金屬螯合磁珠(磁珠-1DA)。
[0024](4)表面銅離子的螯合:將制備的磁珠-1DA (10 mg/ml)與0.5mol/L硫酸銅溶液
1:1，室溫下孵育30min后，用蒸餾水清洗三次，得到表面螯合銅的磁珠(磁珠-1DA-CU)。該方法制得的銅螯合磁珠在0.5mol/L硫酸銅溶液中每毫升能吸收Immol Cu2+。
[0025]二、植物蛋白的提取
用100 μ mo I L1硫酸銅處理的萌發(fā)的水稻種胚，銅處理5天后取新鮮的水稻種胚，用液氮充分研磨，然后加入蛋白提取液；充分混勻后放在4°C下提取30 min，在4°C下、15, OOOXg離心30 min,收集上清。用修改的Bradford法(Ramagli，1999)對變性蛋白進行定量，以雞卵清蛋白作為標準蛋白。研磨后生物組織或細胞與蛋白提取液的固液比為:1:4 ；所述蛋白提取液的組成成份為:每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸鈉，pH 7.8, 300mmol/L氯化鈉，質量百分比為0.2%的Triton X-100, 8mol/L尿素，余量為水；
三、銅螯合磁珠對銅蛋白質組的分離
(1)、按照濃度為10mg/ml的銅螯合磁珠與變性的蛋白溶液體積比為1:1的比例，將濃度為10 mg/ml的銅螯合磁珠與(I)獲得的變性的蛋白溶液進行混合，置于25°C -37下孵育15-30min，得到磁珠蛋白混合溶液；
(2)、在低溫條件下，在磁珠蛋白