一種兩親性自組裝超短肽納米止血材料的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種兩親性自組裝超短肽納米止血 材料。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于外傷、手術(shù)等會出現(xiàn)大量出血的狀況，如果不及時止血，可能會引起感染和創(chuàng) 傷加劇，因此控制出血是急救和創(chuàng)傷治療的重要步驟。目前局部止血材料主要包括沸石類、 多聚糖類如殼聚糖和生物材料類如明膠等。沸石類效果好、成本低但有放熱反應(yīng)且顆粒不 易除去；多聚糖類生物相容性好但對傷口大小形狀等有要求；生物材料類可吸收性好，有 益于傷口愈合，不留傷疤，其缺點(diǎn)是成本高昂，止血速度慢（一種戰(zhàn)爭創(chuàng)傷快速止血產(chǎn)品及 其制備方法，專利CN103816562A;牛金柱，牛金亮，常誠，局部止血材料的作用機(jī)制及應(yīng) 用，人民軍醫(yī)2001年第44卷第9期（總第502期））因此需要一類止血迅速、無毒副作、不 增加感染機(jī)會、不影響組織愈合的新型止血材料。肽分子自組裝技術(shù)已成為生物學(xué)、化學(xué)、 醫(yī)學(xué)、材料學(xué)等學(xué)科的交叉點(diǎn)，是創(chuàng)造新物質(zhì)的重要手段。國內(nèi)外已有報(bào)道，短肽材料與出 血點(diǎn)處的血液相互作用，可誘導(dǎo)短肽材料快速自組裝形成納米纖維水凝膠而起到止血作用 的目的。（US5670483 ;W0 2005/014615A2;ZhongliLuo,ShunkangWang,ShuguangZhang， Fabricationofself-assemblingd-formpeptidenanofiberscaffoldd_EAK16for rapidhemostasis，Biomaterials，32 (8)，2013 - 2020)目前現(xiàn)有技術(shù)公開的能自組裝形成 納米級水凝膠止血材料的自組裝短肽在結(jié)構(gòu)上具有全程電荷匹配的特點(diǎn)，同時氨基酸個數(shù) 含量較多（如RADA，EAK含有16個氨基酸），增加合成成本。同時也有含有半程電荷匹配 的特點(diǎn)的 9 肽止血材料（PX7P,CH3C0-Pr〇-Ser-Phe-Cys-Phe-Lys-Phe-Glu-Pr〇-NH2 及八。-Pr〇-Xl-Phe-X2-Phe-Arg-Phe-Glu-Pr〇-NH2,XI,X2為不帶電疏水氨基酸）該序列帶電氨基 酸殘基位于短肽序列的中間，自組裝后形成的水凝膠機(jī)械強(qiáng)度不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供一種兩親性自組裝超短肽納米止血材，在生理?xiàng)l件下自組裝形成納米 纖維結(jié)構(gòu)，與血液接觸的一瞬間能形成高強(qiáng)度的水凝膠，具有快速止血功能，同時該系列短 肽毒性低、生物相容性好且不引起淋巴細(xì)胞產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)。
[0004] 本發(fā)明的兩親性自組裝超短肽，其氨基酸序列通式為I3-X-Q-G-Ku2)，其中X為疏 水氨基酸；優(yōu)選為亮氨酸（Leu)、擷氨酸（Val)或天冬酰胺（Asn);
[0005] 作為優(yōu)選，兩親性自組裝超短肽的氨基酸序列為IIILQGK(SEQIDNO: 1)， IIIVQGK(SEQIDNO:2)及IIINQGK(SEQIDNO:3);
[0006] 作為優(yōu)選，兩親性自組裝超短肽的氨基酸序列為IIILQGKK(SEQIDN0:4);
[0007] 其中N端可以不保護(hù)或乙酰化，C端可以不保護(hù)或者氨基化；
[0008] 本發(fā)明的兩親性自組裝超短肽用于制備止血材料；
[0009] 本發(fā)明另一個方面還提供一種納米止血材料，是使用上述的兩親性自組裝超短肽 制備的。
[0010] 本發(fā)明所帶來的有益技術(shù)效果：
[0011] 1、本發(fā)明提出了一組新型的自組裝短肽，該短肽具有一端親水、一端疏水的兩親 性特征，該短肽在生理?xiàng)l件下自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)且形成水凝膠，豐富了肽水凝膠形 成的種類。
[0012] 2、本發(fā)明涉及的兩親性自組裝短肽，氨基酸含量較少，合成成本低，合成條件易于 控制，與血液接觸的一瞬間能形成高強(qiáng)度的原位水凝膠，具有快速止血功能，同時該系列短 肽毒性低、生物相容性好且不引起淋巴細(xì)胞產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)，是一類較為理想的納 米止血材料。其應(yīng)用不僅能豐富現(xiàn)有的納米醫(yī)藥材料的種類，而且對人類生命健康具有重 要意義。
【附圖說明】
[0013] 圖1 :本發(fā)明的兩親性短肽IIIVQGK，IIILQGK樣品在20°C條件下圓二色譜圖。
[0014] 圖2:本發(fā)明的兩親性短肽IIILQGK樣品在HEPES (pH7. 2)溶液中自組裝形貌a)原 子力顯微鏡形貌圖，b)透射電子顯微鏡形貌圖。
[0015] 圖3:本發(fā)明的兩親性短肽IIILQGK樣品在HEPES溶液中加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶1小 時后的自組裝形貌a)原子力顯微鏡形貌圖，b)投射電子顯微鏡形貌圖。
[0016] 圖4:本發(fā)明的兩親性短肽IIIVQGK樣品在HEPES (pH7. 2)溶液中自組裝形貌a)原 子力顯微鏡形貌圖，b)透射電子顯微鏡形貌圖。
[0017] 圖5 :本發(fā)明的兩親性短肽IIIVQGK樣品在HEPES溶液中加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶1小 時后的自組裝形貌a)原子力顯微鏡形貌圖，b)透射電子顯微鏡形貌圖。
[0018] 圖6:本發(fā)明所述的兩親性短肽IIIVQGK樣品在HEPES溶液中加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨 酶1小時后形成水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度（存儲模量和損耗模量）與頻率之間的關(guān)系。
[0019] 圖7:本發(fā)明所述的兩親性短肽IIIVQGK，IIILQGK樣品在HEPES溶液中加入谷氨 酰胺轉(zhuǎn)氨酶后形成水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度（存儲模量和損耗模量）隨時間增加的改變。
[0020] 圖8:本發(fā)明所述的兩親性短肽IIILQGK樣品在HEPES溶液中加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨 酶1小時后形成水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度（存儲模量和損耗模量）與頻率之間的關(guān)系。
[0021] 圖9:本發(fā)明所述的兩親性短肽IIILQGK樣品在HEPES溶液中加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨 酶后形成水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度（存儲模量和損耗模量）隨時間增加的改變。
[0022] 圖10:本發(fā)明所述的兩親性短肽IIILQGK樣品在HEPES溶液中加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨 酶后形成水凝膠的對淋巴細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響。
[0023] 圖11 :本發(fā)明所述的兩親性短肽IIILQGK樣品與血液接觸的瞬間產(chǎn)生水凝膠形貌 圖以及水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度檢測。
[0024] 圖12 :本發(fā)明所述的兩親性短肽IIIVQGK，mLQGK，IIINQGK樣品與血液接觸的瞬 間產(chǎn)生水凝膠形貌圖。
[0025] 圖13 :本發(fā)明所述的兩親性短肽IIIVQGK,mLQGK，IIINQGK樣品凝血時間和出血 量。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明提供一種兩親性自組裝超短肽，其氨基酸序列通式為I3-X-Q-G-Ku2)，其中 X為疏水氨基酸；優(yōu)選為亮氨酸（Leu)、擷氨酸（Val)或天冬酰胺（Asn);
[0027] 本發(fā)明所述的短肽可采用固相合成法進(jìn)行合成和生產(chǎn)：以Fmoc保護(hù)的氨基酸為 原料，MBHA樹脂（RinkAmide-MBHAResin)為載體，經(jīng)過脫保護(hù)、肽鍵縮合、氨基末端乙酰 化等步驟，按已知序列從C-端到N-端的順序依次偶聯(lián)合成。合成反應(yīng)完成后，TFA裂解液 將合成的短肽從樹脂上裂解下來，同時脫去氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，冷乙醚反復(fù)沉淀溶液 中的多肽，獲得多肽粗產(chǎn)品，然后經(jīng)高壓液相反相層析柱分離純化多肽粗產(chǎn)品，收集主峰， 冷凍干燥后，獲得目標(biāo)短肽。
[0028] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的兩親性短肽自組裝機(jī)理是短肽分子間通過非共價(jià)鍵相互作用自發(fā) 組合形成的一種結(jié)構(gòu)明確、構(gòu)造穩(wěn)定、具有兩親性的分子聚集體，該短肽能在緩沖液中自組 裝形成長的纖維結(jié)構(gòu)。
[0029] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的兩親性短肽可應(yīng)用于納米止血材料中。實(shí)驗(yàn)表明兩親性短肽溶液與 非抗凝血接觸后，在與血液接觸的一瞬間使血液凝固，形成機(jī)械強(qiáng)度非常高的水凝膠，起到 快速止血的效果，可用于止血藥物。本發(fā)明設(shè)計(jì)的兩親性短肽組成為天然氨基酸，組織相容 性好，且不誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生非特異性炎癥反應(yīng)，因此可將短肽材料制備成一種適用于臨 床上適用的納米止血藥物。
[0030] 下面對本發(fā)明所用部分實(shí)驗(yàn)儀器的型號及規(guī)格進(jìn)行說明：
[0031] MOS450CD光譜儀（Bio-Logic，法國）；
[0032] 電熱恒溫孵育箱（DNP-9082,上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；
[0033]干燥消毒烤箱（DHG-9246A，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；
[0034] 紫外分光光度計(jì)（美國Bio-tek儀器公司）；
[0035] 臺式離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；
[0036] 原子力顯微鏡（AFM)(NanoscopeIvaMultiModeAFM，DigitalInstruments)
[0037] 流變儀（MarsIII，Haake)
[0038] 超凈工作臺（Airtech，江蘇安泰）
[0039]恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERACELL150i，Thermor，法國）
[0040] 倒置顯微鏡（TS100,Nikon，日本）
[0041] 熒光倒置顯微鏡（DMI3000B，Leica，德國）
[0042] -次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶（25cm2,Corning，costar)
[0043] 一次性移液管（5mLin0.ImL,Corning,costar)
[0044] 一次性細(xì)胞培養(yǎng)板（3599,Corning，costar)
[0045] 一次性細(xì)胞培養(yǎng)板（3548,Corning，costar)
[0046] 液氮容器（YDS-30-125,東亞液氮容器）
[0047] 微波固相抗菌肽合成儀（CEM公司的Liberty微波抗菌肽自動合成儀）。
[0048] 對于本發(fā)明的短肽I3-X-Q-G-Ku2)中涉及的氨基酸的術(shù)語解釋如下：
[0049] I為異亮氨酸；Q為谷氨酰胺；G為甘氨酸；K為賴氨酸；L為亮氨酸；N為天冬酰胺。 上述用到的氨基酸的信息如下：
[0050]
[0052] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的兩親性短肽的合成做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0053] 實(shí)施例1:
[0054] 本發(fā)明的兩親性自組裝超短肽，其氨基酸序列通式為I3-X-Q-G-Ku2)，如上式中，X 選自Val，K的個數(shù)為1，多肽N端乙?；珻端氨基化，其氨基酸序列如下式：
[0055]乙?；疉c-IIIVQGK-NH2 ;(簡稱為IIIVQGK)
[0056] 上述兩親性短肽（兩親性短肽樣品1)的制備方法：
[0057] 步驟1 :蒸餾二氯甲烷（DMF)和二甲基甲酰胺（DCM)溶劑
[0058] 將購買的DMF溶液在60°C條件下減壓蒸餾，去除蒸餾前后液各IOmL左右，得到純 的DMF溶劑；將購買的DCM進(jìn)行減壓蒸餾，首先加入少量CaH2吸水劑，懸蒸2-3小時，然后 再常壓蒸餾得到純的DCM溶劑。
[0059] 步驟2:氨基酸、樹脂、活化劑、蓋帽劑、去保護(hù)劑等的配制
[0060] 多肽固相合成儀上計(jì)算出制備0. 25mMAc-IIILQGK-NH2所需氨基酸和其他試劑的 用量（為保證多肽合成時，兩親性短肽的純度，氨基酸的用量加倍，其終濃度為0.2M):
[0061] Gly(甘氨酸）：0? 65g溶于IlmLDMF中；
[0062] Gln(谷氨酰胺）：1. 34g溶于IlmLDMF中；
[0063]Lys(賴氨酸）：I. 03g溶于IImLDMF中；
[0064] Ile(異亮氨酸）：2. 26g溶于 32mLDMF中；
[0065] Leu(亮氨酸）：0?77g溶于IlmLDMF中；
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