一種寡肽及其在制備抗癌抑菌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及寡肽及其應(yīng)用，尤其涉及一種寡肽及其在制備抗癌抑菌藥物中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 寡肽（也稱小肽）是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。自從生物化學(xué) 家用人工方法合成小肽40多年以來(lái)，伴隨著分子生物學(xué)，生物化學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，寡肽 (小肽）的研究取得了驚人的，劃時(shí)代的發(fā)展。
[0003]目前發(fā)現(xiàn)存在于生物體的小肽已有數(shù)萬(wàn)種，并且發(fā)現(xiàn)所有的細(xì)胞都能合成小肽， 并幾乎所有也都受小肽的調(diào)節(jié)，它涉及激素，神經(jīng)，細(xì)胞生長(zhǎng)和生殖等各個(gè)領(lǐng)域。寡肽作為 動(dòng)物消化道蛋白質(zhì)的主要酶解產(chǎn)物，是迅速吸收的氨基酸供體，同時(shí)釋放的肽具有活性作 用，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的生命活動(dòng)。多肽類藥物的研究主要包括抗腫瘤多肽、抗菌性活性肽、多 肽導(dǎo)向藥物、多肽疫苗、細(xì)胞因子模擬肽、診斷用多肽及其它藥用小肽等方面。多肽類藥物 的主要特點(diǎn)是用量小，生物活性強(qiáng)，對(duì)癌癥、自身免疫性疾病、記憶力減退、精神失常、高血 壓和某些心血管及代謝等疾病有顯著的療效。隨著醫(yī)學(xué)及生化技術(shù)的發(fā)展，多肽類藥物將 成為21世紀(jì)重要的診斷、監(jiān)測(cè)、預(yù)防和治療藥，具有廣闊的前景。因此，研究和開(kāi)展多肽藥 物具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種寡肽及其在制備抗癌抑菌藥物中 的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述的寡肽，其特征在于：該寡肽的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0006] 具體的，SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列描述是：
[0007] LeuAsp Ala Cys ArgHeAla
[0008] 上述寡肽氨基酸數(shù)目為7個(gè)，不需任何修飾連接，為線性多肽，且人工合成方便； 試驗(yàn)證明其具有抑菌與抗癌細(xì)胞生長(zhǎng)兩種功能，同等濃度下對(duì)人正常細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制活 性，顯示對(duì)人正常細(xì)胞無(wú)毒性。
[0009] 本發(fā)明所述寡肽在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
[0010] 實(shí)驗(yàn)顯示：本發(fā)明所述寡肽能抑制肺癌、胃癌、宮頸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)，提示其在癌 癥臨床治療中具有重要的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。
[0011] 上述制備抗癌藥物中的應(yīng)用中，所述抗癌藥物優(yōu)選是抗肺癌藥物。
[0012] 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示：本發(fā)明的寡肽對(duì)肺癌細(xì)胞株及人肺癌紫杉醇抗性株H460taxR 的生長(zhǎng)有較明顯的抑制作用，同等濃度下對(duì)人正常成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)有影響，揭示本發(fā)明 的寡肽為制備治療具有紫杉醇抗性的肺癌相關(guān)的藥物奠定了基礎(chǔ)并在肺癌臨床治療中具 有關(guān)闊的應(yīng)用前景。
[0013] 本發(fā)明所述寡肽在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
[0014] 實(shí)驗(yàn)顯示：本發(fā)明所述寡肽可以抑制革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和霉菌等多種 致病菌的生長(zhǎng)，為新型抗菌藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
[0015] 上述制備抗菌藥物的應(yīng)用中，所述抗菌藥物優(yōu)選是抗細(xì)菌藥物。
[0016] 本發(fā)明提供的寡肽及其在制備抗癌抑菌藥物中的應(yīng)用為尋找全新類型的抗生素 或抗癌藥物進(jìn)而解決耐藥性問(wèn)題或克服化療耐藥性等問(wèn)題開(kāi)辟了一條有效途徑，具有廣闊 的因應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1.本發(fā)明所述寡肽對(duì)H460、H460taxjPNHFB細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用檢測(cè)。
[0018] 圖2.本發(fā)明所述寡肽對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的抑制作用檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1 :
[0020] 寡肽的設(shè)計(jì)與合成
[0021] 1、登陸國(guó)際主要抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)，網(wǎng)址如下：
[0022] (http: //aps.unmc.edu/AP/main.php；http://penbase.immunaqua.com/ ； http://www.bbcm.univ.trieste.it/ ；http://www.imtech.res.in/raghava/antibp/)
[0023] 提取其中的抗菌肽的序列，分析其一級(jí)結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系的對(duì)應(yīng)關(guān)系，同時(shí)設(shè)計(jì) 人工短肽序列。
[0024] 2、利用蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.expasy.org/，分析已知活性的多肽序列與 設(shè)計(jì)的寡肽序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似度，結(jié)合其它物理化學(xué)參數(shù)預(yù)測(cè)進(jìn)行設(shè)計(jì)序列的修正。
[0025] 3、寡肽序列送至生物公司合成或利用自動(dòng)多肽合成儀合成全序列。HPLC檢測(cè)純度 要大于96%，同時(shí)通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)確定寡肽合成質(zhì)量。樣品以凍干狀態(tài)保存。
[0026] 4、對(duì)合成后的寡肽進(jìn)行抑菌及抗癌功能檢測(cè)篩選。
[0027] 5、通過(guò)功能檢測(cè)，最終獲得具有抑菌及抗癌雙重功能的寡肽序列，即本發(fā)明中所 述的寡肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)euAspAlaCysArglieAla。
[0028] 實(shí)施例2 :
[0029] 本發(fā)明所述寡肽體外抑癌活性
[0030] 2. 1材料與試劑
[0031] 1)本發(fā)明所述寡肽，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成
[0032] 2)H460細(xì)胞（人非小細(xì)胞肺癌株系）、H460taxR細(xì)胞（人肺癌細(xì)胞H460株系，抗紫 杉醇）、NHFB細(xì)胞（人正常成纖維細(xì)胞株系）、Hela細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞），SGC-7901細(xì)胞 (人胃癌細(xì)胞株系），中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。
[0033] 3)RPMI1640培養(yǎng)基，為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品
[0034] 4)DMEM培養(yǎng)基，為美國(guó)HyClone公司產(chǎn)品
[0035] 5)新生小牛血清，為杭州四季青公司產(chǎn)品
[0036] 6)二甲基亞砜（DMSO)，四甲基偶氮唑（MTT)為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公 司，其它藥品試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0037]2. 2 實(shí)驗(yàn)
[0038] 1)用稀釋液（無(wú)菌PBS或無(wú)菌水或者相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基）將本發(fā)明所述寡肽稀釋 至ImM的初始測(cè)量濃度，過(guò)濾除菌，分裝后_20°C凍存。
[0039] 2)培養(yǎng)各種細(xì)胞：將已經(jīng)復(fù)蘇的癌細(xì)胞株與正常細(xì)胞株分別用相應(yīng)的培養(yǎng)液進(jìn) 行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件：37°C，5%二氧化碳，飽和濕度。待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后以4萬(wàn)個(gè)/ mL密度接種96孔板，每孔100yL于0)2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以便細(xì)胞適當(dāng)增殖并充分 貼壁。
[0040] 3)細(xì)胞已貼壁后，棄去孔中原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有梯度稀釋（在初始濃 度基礎(chǔ)上以10倍體積稀釋）寡肽的100yL培養(yǎng)基。陰性對(duì)照組加入含有同等濃度稀釋液 的同體積培養(yǎng)基，CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。
[0041] 4)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，然后每孔加入20yI(5mg/mL)MTT溶液。培養(yǎng)4h。
[0042] 5)小心吸盡孔中液體，每孔加入150yIDMS0,置于水平搖床上輕搖lOmin，以使 紫色結(jié)晶充分溶解于DMSO中。
[0043] 6)使用Model680酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在570nm處的吸光值，記錄數(shù)據(jù)。
[0044] 7)利用sigmaplotlO和Excel軟件分析處理數(shù)據(jù)。
[0045] 結(jié)果顯示，本發(fā)明的寡肽在小于ImM濃度下能抑制肺癌、胃癌、宮頸癌細(xì)胞株的 生長(zhǎng)，在0.ImM濃度下人肺癌紫杉醇抗性株H460taxj^生長(zhǎng)存活率為48%，H460存活率為 85%，而正常細(xì)胞存活率為144%。結(jié)果見(jiàn)附圖1。
[0046] 顯微鏡觀察可見(jiàn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)小泡并有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā) 生。
[0047] 實(shí)驗(yàn)證實(shí)：本發(fā)明的寡肽具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷能力，有望直接用于制備 癌癥治療的藥物，或者開(kāi)發(fā)為聯(lián)合化療的臨床藥物，應(yīng)用前景可觀。
[0048] 實(shí)施例3 :
[0049] 利用液體生長(zhǎng)抑制法檢測(cè)本發(fā)明所述寡肽的抑菌活性
[0050]3.1材料、試劑
[0051] 1)氨節(jié)青霉素（Amp)為solarbio公司產(chǎn)品，一次性濾器，為美國(guó)PALL公司產(chǎn)品， 其它藥品試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0052]2)選用革蘭氏陽(yáng)性菌：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn)、金 黃色葡萄球菌（StaphyloccocusaureusRosenbach)、藤黃微球菌（MicrococcusIuteus)、 蘇云金芽抱桿菌（Bacillusthuringiensis)、巨大芽胞桿菌（Bacillusmegaterium);革 蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichiacoli)、弧菌（Vibrio)、肺炎克氏桿菌（Klebsiella pneumoniae);真菌：前病鏡刀菌（Fusariumsolani)、尖抱鏡刀菌（Fusariumoxysporum)、 瓜類炭疽病菌（Colletetrichumlagenarium)、蘋(píng)果炭疽病菌（Gloeosporiumalbum)棉花 黃萎病菌（Verticilliumdahliae)進(jìn)行測(cè)試。山東大學(xué)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物菌 種室提供。
[0053] 3)封閉液：0.4%BSA(w/v)，0. 02%冰醋酸，配制后過(guò)濾除菌。
[0054] 4)PB液體培養(yǎng)基
[0055]胰蛋白胨（Tryptone) l〇g/L
[0056]氯化鈉（NaCl) 5g/LPH7. 4-7. 6
[0057]3. 2實(shí)驗(yàn)
[0058] 1)向無(wú)菌96孔酶標(biāo)板所使用的孔中加入200yL封閉液，室溫封閉24h。
[0059] 2)用PB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)不同的細(xì)菌，轉(zhuǎn)培養(yǎng)使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用PB 培養(yǎng)基調(diào)整菌液OD6。。約為0. 002。
[0060] 3)棄去封閉液，每孔加90yLOD6。。約為0. 002的含菌PB培養(yǎng)基，再加入10yL無(wú) 菌水配好的終濃度梯度為50yM、IyM、0. 5yM的本發(fā)明的寡肽。陰性對(duì)照為90yL含菌培 養(yǎng)基+10yL無(wú)菌水；陽(yáng)性對(duì)照為90y1含菌培養(yǎng)基+10yL濃度為0.25mg/mL氨芐青霉素 溶液（終濃度為〇?〇25mg/mL，約62 y M)。
[0061] 4)將加好菌液和藥品的酶標(biāo)板置于28°C搖床，IOOrpm恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后 0h、3h、12h、15h、24h、36h，用BIOTEKELX800 酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的 630nm吸光值（OD630)。
[0062] 5)利用sigmaplotlO和Excel軟件分析處理數(shù)據(jù)。
[0063] 結(jié)果表明：本發(fā)明的寡肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（以枯草芽孢桿菌為例）有一定的抑菌 作用，且濃度越大抑菌效果越明顯；短時(shí)抑菌效果明顯。50yM濃度在3小時(shí)的抑菌效果要 優(yōu)于青霉素陽(yáng)性對(duì)照組（62yM)。對(duì)革蘭氏陰性菌（以大腸桿菌為例），抑菌效果受濃度影 響不大。長(zhǎng)時(shí)抑菌效果明顯。50yM濃度時(shí)15小時(shí)抑菌效果優(yōu)于青霉素對(duì)照（62yM)。對(duì) 真菌的抑菌效果與革蘭氏陰性菌的類似。具體結(jié)果見(jiàn)附圖2。
[0064] 由結(jié)果顯示該寡肽有望用于制備相關(guān)的臨床用新型抗菌藥物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種寡肽，其特征在于：所述寡肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 權(quán)利要求1所述寡肽在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抗癌藥物是抗肺癌藥物。4. 權(quán)利要求1所述寡肽在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抗菌藥物是抗細(xì)菌藥物。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種寡肽及其在制備抗癌抑菌藥物中的應(yīng)用，其中所述寡肽的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的寡肽對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷能力，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌短時(shí)抑菌效果明顯，對(duì)革蘭氏陰性菌長(zhǎng)時(shí)抑菌效果明顯。對(duì)真菌的抑菌效果與革蘭氏陰性菌的類似。其有望直接用于制備抗癌抑菌藥物并克服耐藥性問(wèn)題，應(yīng)用前景可觀。
【IPC分類】A61P31/04, A61K38/08, A61P35/00, A61P31/10, C07K7/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105085623
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510590713
【發(fā)明人】馬韞韜, 王麗
【申請(qǐng)人】馬韞韜
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年9月16日