光滑爪蟾皮膚抗菌肽及其制備方法與用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物化學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種光滑爪蟾皮膚抗菌肽及其制備方 法與用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽（Antibacterialpeptide)，又稱(chēng)為抗微生物肽，是免疫系統(tǒng)釋放的具有抗 微生物活性的物質(zhì)，作為先天性免疫成分的一部分廣泛存在于自然界的生物體內(nèi)。抗菌肽 是一種小分子的多肽類(lèi)物質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性，表現(xiàn)在其具有殺菌、消炎、抗病毒、抑 制腫瘤等作用，是生物非特異性防御系統(tǒng)的重要組成部分?？咕木哂袕V譜的抗菌活性，可 與革蘭陰性菌外膜的脂多糖以及革蘭陽(yáng)性菌表面的肽聚糖結(jié)合，從而破壞胞膜而形成穿膜 通道，細(xì)胞內(nèi)容物泄露或因離子流出后高滲破裂而死亡，不易產(chǎn)生耐藥性。因此，抗菌肽作 為一種具有高效生物活性且不易產(chǎn)生耐藥性的小分子肽，具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 兩棲動(dòng)物的皮膚裸露直接與生活環(huán)境相接觸，沒(méi)有鱗片、甲殼以及毛發(fā)的保護(hù)，但 在兩棲動(dòng)物皮膚的表面，經(jīng)常會(huì)有黏液性的物質(zhì)覆蓋在表面形成了保護(hù)屏障。此屏障中含 有大量的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的大分子物質(zhì)以及功能多樣的抗菌活性物質(zhì)，抗菌肽作為其中的成 分，發(fā)揮重要的作用。
[0004] 抗菌肽作為抑菌藥物的研究已經(jīng)廣泛深入，其中，小分子抗菌肽的研究成果尤為 顯著，小分子抗菌肽不但具有高效的抑菌活性，還由于其分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單而具備合成成本低， 不存在免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。在公開(kāi)號(hào)為103641901A的中國(guó)專(zhuān)利中，公開(kāi)了一種序列為GLPLLI SWIKRKRQQAGPGSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM的抗菌肽。在公開(kāi)號(hào)為102140130A的中國(guó)專(zhuān)利中， 公開(kāi)了一種序列為KCRRRKVHGPMIRIRKK的抗菌肽。上述兩種抗菌肽由于其序列較長(zhǎng)，存在 二級(jí)結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致其合成難度、成本較高。在公開(kāi)號(hào)為103524602A的中國(guó)專(zhuān)利中，公開(kāi)了 一種序列為RRRffffC的6肽抗菌肽，不過(guò)該發(fā)明中僅闡明了其病毒活性，沒(méi)有明確其抗腫瘤 等其他功效，并且該專(zhuān)利沒(méi)有研究該抗菌肽的溶血活性，大大限制了其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種光滑爪蟾皮膚抗菌肽及其制備方法與用途。
[0006] 本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是： 本發(fā)明的光滑爪蟾皮膚抗菌肽，是包括4分子天冬氨酸和1分子谷氨酸的序列為Asp-Glu-Asp-Asp-Asp即DEDDD的 5 肽。
[0007] 本發(fā)明還可以采用以下技術(shù)措施： 本發(fā)明的光滑爪蟾皮膚抗菌肽是由4分子天冬氨酸以及1分子谷氨酸組成的序列為Asp-Glu-Asp-Asp-Asp即DEDDD的 5 肽，其分子量為 607. 7Da。
[0008] 本發(fā)明的光滑爪蟾皮膚抗菌肽的制備方法，包括以下步驟： A、 提取光滑爪蟾皮膚分泌物； B、 制備型高效液相色譜分離純化； C、 制備液相分離峰的活性檢測(cè)； D、 分析型高效液相色譜分離純化； E、 分析液相分離峰的活性檢測(cè)及質(zhì)譜鑒定。
[0009] 所述的步驟A中光滑爪蟾皮膚分泌物由物理刺激光滑爪蟾皮膚后得到。
[0010] 所述的物理刺激為恒壓電刺激，電壓為15-20V。
[0011] 本發(fā)明的光滑爪蟾皮膚抗菌肽在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的光滑爪蟾皮膚抗菌肽在制備由細(xì)菌引起的抗菌藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的光滑爪蟾皮膚抗菌肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的光滑爪蟾皮膚抗菌肽在制備治療乳腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是： 本發(fā)明采用物理方法對(duì)皮膚進(jìn)行刺激，極大程度地保護(hù)了抗菌肽的結(jié)構(gòu)完整性以及生 物學(xué)活性；其次，本發(fā)明公開(kāi)的抗菌肽為小分子多肽，有利于皮膚吸收，還大大降低了其化 學(xué)合成的難度及成本，增強(qiáng)了其應(yīng)用的可能性。最后，本發(fā)明公開(kāi)的抗菌肽具有顯著的抑菌 活性，較低的溶血活性以及良好的抗乳腺癌細(xì)胞活性，并且沒(méi)有毒副作用，也不易產(chǎn)生耐藥 性，從而大大增強(qiáng)了應(yīng)用范圍。綜合以上優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明提供的抗菌肽可以應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn) 中。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是本發(fā)明的光滑爪蟾皮膚抗菌肽的色譜圖； 圖2是本發(fā)明的光滑爪蟾皮膚抗菌肽的質(zhì)譜圖； 圖3是本發(fā)明的光滑爪蟾抗菌肽的固相合成色譜圖； 圖4是本發(fā)明的光滑爪蟾抗菌肽的固相合成質(zhì)譜圖； 圖5是不同濃度本發(fā)明的光滑爪蟾抗菌肽的溶血率； 圖6是不同濃度本發(fā)明的光滑爪蟾抗菌肽對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制率。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明的光滑爪蟾皮膚抗菌肽是由4分子天冬氨酸以及1分子谷氨酸組成的序列 為Asp-Glu-Asp-Asp-Asp即DEDDD的 5 肽，其分子量為 607. 7Da，命名為XLAsp-Pl。
[0018] 1、本發(fā)明的光滑爪蟾皮膚抗菌肽采用以下方法制備： I. 1光滑爪蟾皮膚分泌物的獲取 取100只光滑爪蟾，用蒸餾水將其皮膚表面清洗干凈，去除雜質(zhì)。利用15V的直流電， 間斷性的刺激皮膚表面，誘導(dǎo)皮膚分泌。10min左右可見(jiàn)皮膚分泌出較多無(wú)色透明物質(zhì)，同 時(shí)夾雜著白色黏液狀物質(zhì)。使用電壓15-20V之間的直流電都可以收到上述分泌效果，用超 純水收集分泌物，12000rpm離心15min，去除沉淀取上清。上清經(jīng)0. 45ym濾膜過(guò)濾后，用 10KDa的超濾管12000rpm離心20min，以去除大分子蛋白。用金黃色葡萄球菌S.aureus ATCC29213檢測(cè)粗提物的抗菌活性，利用凍干機(jī)對(duì)粗提物進(jìn)行濃縮，后在-40 °C保存。
[0019] 1. 2制備型高效液相色譜分離純化 將半制備型C18柱同儀器相連接，并且將流動(dòng)相A(上樣緩沖液，水+0. 05%TFA)，B(洗 脫緩沖液，乙腈+0.05%TFA)同儀器的栗相通。調(diào)試儀器，并用A液平衡系統(tǒng)，直至吸收值 達(dá)到平衡。然后設(shè)置自動(dòng)上樣2mL/次，自動(dòng)收集程序2min/管，流速為2mL/min。并且 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)置洗脫程序，如下面表1所示。多次上樣，將相同時(shí)間的組分合并，而 后進(jìn)行濃縮。
1. 3制備液相分離峰的活性檢測(cè) 以金黃色葡萄球菌S.aureusATCC29213作為活性檢測(cè)使用菌種，利用藥敏片法體外檢 測(cè)分離峰的活性。將菌液稀釋到〇. 5麥?zhǔn)蠞岫群笕OOML涂到直徑為90mm的細(xì)菌培養(yǎng)板 上，待即將風(fēng)干時(shí)，把各個(gè)分離峰制作的藥敏片貼附在瓊脂表面，37 °C溫箱培養(yǎng)過(guò)夜，根據(jù) 抑菌圈的有無(wú)和大小判定分離峰的活性有無(wú)和強(qiáng)弱，具有活性的分離峰作進(jìn)一步分離。 [0021] 1. 4分析型高效液相色譜分離純化 為了確定每個(gè)活性峰中的活性物質(zhì)，得到純度更高的樣品從而便于測(cè)序?qū)嶒?yàn)的進(jìn)行， 我們利用分析型高效液相色譜（AnalyticalHighPerformanceLiquidChromatography， AnalyticalHPLC)儀對(duì)活性峰作進(jìn)一步的分離。首先將分析型C18柱同儀器相連接，并且 將流動(dòng)相A(上樣緩沖液，水+0. 05%TFA)，B(洗脫緩沖液，乙腈+0. 05%TFA)同儀器的栗對(duì) 應(yīng)相通。調(diào)試儀器，A栗和B栗分別purge，并用A液平衡系統(tǒng)，直至吸收值達(dá)到平衡。設(shè)置 流速為lmL/min，手動(dòng)上樣IOOuL/次，根據(jù)吸收峰手動(dòng)收集。多次上樣，合并相同峰并進(jìn)行 濃縮。洗脫程序設(shè)置如表2所示，不同樣品根據(jù)第一次洗脫效果改動(dòng)洗脫程序。
1. 5分析液相分離峰的活性檢測(cè)及質(zhì)譜鑒定 活性檢測(cè)的方法同1. 3。利用MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜儀對(duì)具有抑菌活性的分離峰進(jìn)行 鑒定，包括分子量以及純度。首先將IyL的分離樣品和肽標(biāo)準(zhǔn)分別點(diǎn)于拋光靶上，風(fēng)干 后，再加IuL飽和a-CCA基質(zhì)（溶劑：0. 1%三氟乙酸+ 50%乙腈）于樣品表面，自然干燥。 MALDL-T0F/T0F采用的是正離子和自動(dòng)獲取模式采集數(shù)據(jù)。先通過(guò)利用肽標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正， 并設(shè)定的質(zhì)量掃描范圍為0-4KDa，從而獲得樣品一級(jí)質(zhì)譜圖。通過(guò)分析質(zhì)譜，獲得純度較 高的(達(dá)到95%)的組分可進(jìn)行氨基酸序列的測(cè)定。最終分離到符合要求的為第4-9號(hào)峰的 抗菌肽，其色譜及質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1、圖2所示。
[0023] 2、光滑爪蟾皮膚抗菌肽氨基酸序列的測(cè)定 通過(guò)分離純化及質(zhì)譜鑒定，對(duì)達(dá)到測(cè)序要求的抗菌肽進(jìn)行氨基酸測(cè)序。ABI491型氨 基酸序列分析儀的原理是Edman降解法：首先是異硫氰酸苯脂同多肽N-端殘基進(jìn)行偶聯(lián)反 應(yīng)，形成了苯氨基硫甲酰肽（PTC-肽）;然后PTC-肽經(jīng)過(guò)環(huán)化裂解反應(yīng)后形成噻唑呤酮苯氨 氨基酸（ATZ-AA);最后再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，ATZ-AA轉(zhuǎn)化為苯異硫脲氨基酸（PTH-AA)。通過(guò)微 梯度運(yùn)送系統(tǒng)(毛細(xì)管HPLC)與標(biāo)準(zhǔn)的PTH-AA的保留時(shí)間進(jìn)對(duì)比，利用數(shù)據(jù)分析軟件得到 抗菌肽的氨基酸序列。
[0024] 3、光滑爪蟾皮膚抗菌肽序列的生物信息學(xué)分析 通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以及Antimicrobial PeptideDatabase(APD， http://aps.unmc.edu/AP/main.html)兩大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比 較，確定所得到的光滑爪蟾皮膚抗菌肽序列與已知任何序列均不相同，因此可判