一種狄斯瓦螨毒性蛋白及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種狄斯瓦螨毒性蛋白及其編 碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 狄斯瓦螨一直是世界養(yǎng)蜂業(yè)最主要的危害之一，目前全球范圍內(nèi)僅澳大利亞未發(fā) 現(xiàn)（周婦，2005;Rosenkranzetal.，2010)。狄斯瓦螨吸食蜜蜂成蜂或幼蟲的體液，造成 蜜蜂體質(zhì)下降，同時降低蜜蜂的認(rèn)知能力與方向感（Kraljetal.，2007)，降低出勤蜂返巢 率，縮短蜜蜂的壽命（Dainatetal.，2012)，蜂群群勢衰弱。最主要的是狄斯瓦螨還傳播 蜜蜂細(xì)菌和病毒病害（Tentchevaetal.，2004;Yanetal.，2009;Priscoetal.，2011，Ai etal.，2012)，并通過抑制宿主免疫抑制反應(yīng)激活這些潛伏病毒（Yang&Cox-foster，2005 ; Santilldn-Galiciaetal. ,2008)。在美國、希臘等國出現(xiàn)的蜜蜂蜂群崩潰失調(diào)?。–O)) 造成世界恐慌，引起科學(xué)家的高度重視，經(jīng)研究其發(fā)病原因與蜂螨的危害有關(guān)（Cox-Foster etal.，2007)。每年我國養(yǎng)蜂業(yè)僅蜂螨造成的直接損失就達(dá)到幾億人民幣，而且因防治 蜂螨使用藥物造成蜂產(chǎn)品污染（王強等，2006 ;吳杰等，2007 ;周婷等，2007)和狄斯瓦螨 抗藥性及藥物殘留對環(huán)境的影響更是無法估量（胡福良等，2004 ;黃文誠，2005;Sattaet al.，2005 ;曾志將等，2007;Adamczyketal.，2010;Damianietal.，2011 ;Gonzdlez_G6mez etal.，2012)。
[0003] 隨著狄斯瓦螨的擴(kuò)散，以及與宿主之間的相互適應(yīng)，某些意大利蜂和非洲化意 蜂（AfricanizedApismellifera)也表現(xiàn)對狄斯瓦螨的耐受性（Aumeieretal.，2000; Navajasetal. 2008;LeConteetal.，2011)。因此，研究者又一次將目光聚集在蜜蜂對 狄斯瓦螨的耐受性研究方面，并且認(rèn)為有效的清潔行為是最重要的耐受因素（Morettoet al.，2006 ;Calder6netal.，2009;LeConteetal.，2011)。但是清潔打為是如何控制的呢？ 是嗅覺嗎？因為狄斯瓦螨在刺吸食物時分泌的唾液中可能含有某種物質(zhì)使得蜜蜂能夠感 知螨的存在。而事實上中蜂只有在狄斯瓦螨剛進(jìn)入蜂房或者移動的時候反應(yīng)強烈，而狄斯 瓦螨靜止不動的時候蜜蜂不能夠感知的（Rath，1999)，通過分子生物學(xué)手段比較意蜂清潔 蜂的轉(zhuǎn)錄組也不支持清潔蜂有更強的嗅覺靈敏度（LeConteetal.，2011)，并指出有可能 是蜜蜂的群體免疫力使得蜂群耐受狄斯瓦螨。SchSningetal. (2012)則認(rèn)為意蜂的清潔行 為是基于受損傷的幼蟲（狄斯瓦螨與DWV病毒共同導(dǎo)致的殘翅），屬于蜜蜂的免疫反應(yīng)。作 為原始寄主的中華蜜蜂與狄斯瓦螨在長期相互適應(yīng)的過程中產(chǎn)生耐受性，受到廣泛關(guān)注。
[0004] 而在我國飼養(yǎng)廣泛的中華蜜蜂（A.cerana)卻很少遭受狄斯瓦螨的毀滅性破壞。 大量文獻(xiàn)表明，作為原始寄主的中華蜜蜂與狄斯瓦螨在長期相互適應(yīng)的過程中產(chǎn)生耐受 性，中華蜜蜂將狄斯瓦螨種群控制在800只/箱以內(nèi)，則可以維持蜂群的穩(wěn)定（Penget al.，1987a,b;Delfinado_Baker&Peng, 1995 ;Rath, 1999)。研究表明，影響中蜂群內(nèi)狄斯 瓦螨種群大小的因素主要有三個方面：狄斯瓦螨繁殖力（!^production)，中華蜜蜂的抗 螨行為以及狄斯瓦螨的自然死亡。影響狄斯瓦螨繁殖力的因素有：1)雌螨的生育力；2) 蜜蜂蛹的封蓋歷期；3)蜜蜂幼蟲的吸引力；4)巢房大小。中華蜜蜂的抗螨行為有理毛行 為（groomingbehaviour)和清潔行為（Hygienicbehaviour) (Rath，1999)。早期文獻(xiàn) (Rothenbuhler，1964)對清潔行為的定義是比較狹隘的，單純指中蜂"打開房蓋并移走受感 染的病蟲"。但是這種開蓋及移走行為不是專門針對瓦螨的，而是普通的清理行為，針對所 有的外來物質(zhì)或者受微生物危害的幼蟲。后來，Rath(1999)對此進(jìn)行了補充，把清潔行為 定義為"開蓋，移走及埋葬幼蟲"的行為。蜜蜂能夠很快移走工蜂房中的死幼蟲而雄蜂房中 的死幼蟲則很難被移走，中蜂的工蜂讓死亡的雄蜂幼蟲留在房內(nèi)而不去開蓋（雄蜂房有厚 厚的繭也不容易打開），從而埋葬了受狄斯瓦螨感染或患病致死的雄蜂幼蟲。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種對蜜蜂具有毒性作用的狄斯瓦螨毒性蛋白VMP及其編 碼基因VMP。
[0006] 本發(fā)明的狄斯瓦螨毒性蛋白VMP，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0007] 本發(fā)明的狄斯瓦螨毒性蛋白VMP的編碼基因VMP，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所 示。應(yīng)當(dāng)理解，考慮到密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，對上述編碼基因的 核苷酸序列進(jìn)行修改，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0008] 本發(fā)明從狄斯瓦螨的基因組中克隆到一個新的狄斯瓦螨毒性蛋白VMP的編碼基 因VMP，其表達(dá)產(chǎn)物狄斯瓦螨毒性蛋白VMP對蜜蜂具有毒性作用，因此可以將本發(fā)明的狄斯 瓦螨毒性蛋白VMP以及其編碼基因應(yīng)用到制備蜜蜂致死藥物中。本發(fā)明還為在基礎(chǔ)科學(xué)研 究狄斯瓦螨危害蜜蜂的機(jī)理創(chuàng)造了條件。
【附圖說明】：
[0009] 圖1為VMP基因克隆PCR電泳圖，M表示W(wǎng)iderangeDNAMarker，從上至下分別為 6kb，4kb，3kb，2. 5kb，2kb，I. 5kb，lkb，750bp，500bp，250bp，lOObp，擴(kuò)增得到的含有VMP基 因閱讀框的DNA片段為405bp(泳道1);
[0010] 圖2為表達(dá)蛋白VMP純化的SDS-PAGE電泳圖，M表示預(yù)染蛋白marker，從上至下 分別為 170kDa，130kDa，95kDa，72kDa，55kDa，43kDa，34kDa，26kDa，17kDa，10kDa，Linel表 示純化的表達(dá)蛋白VMP，Line2為純化VMP時的洗脫蛋白。
[0011] 圖3為純化表達(dá)狄斯瓦螨毒性蛋白VMP對蜜蜂的毒性測定分析圖，純化的VMP稀 釋為以下濃度：10. 〇8ng/iiL，2ng/iiL，lng/iiL，0.lng/iiL，0. 01ng/iiL分別注射中華蜜 蜂，意大利蜜蜂工蜂預(yù)蛹以及5齡大蠟螟。每頭蟲注射約0.2yL。以以下處理為對照（I): 分離的唾液中的毒性蛋白（purifiedsalivaprotein)，（2)脫鹽的本底表達(dá)蛋白（本底表達(dá) 產(chǎn)物）（Flowthrough)，（3)PBS，（4)不注射任何物質(zhì)的幼蟲（CK)。每處理設(shè)置3個重復(fù)，每 重復(fù)8頭蟲。34°C，80%RH培養(yǎng)。11天后記算死亡率。數(shù)據(jù)處理：SPSS16. 0，AN0VA，單因 素方差分析（Duncan)。圖4為純化表達(dá)狄斯瓦螨毒性蛋白VMP對蜜蜂的毒性測定形態(tài)圖， 純化的VMP稀釋為以下濃度：10. 08ng/iiL，2ng/iiL，lng/iiL，0?lng/iiL，0?Olng/iiL分別 注射中華蜜蜂，意大利蜜蜂工蜂預(yù)蛹以及5齡大蠟螟。每頭蟲注射約0.2uL。以以下處理 為對照：⑴分離的唾液中的毒性蛋白（purifiedsalivaprotein), (2)VMP表達(dá)菌株的本底 表達(dá)蛋白（本底表達(dá)產(chǎn)物）（Flowthrough)，（3)PBS，（4)不注射任何物質(zhì)的幼蟲（CK)。11 天后，中華蜜蜂和意大利蜜蜂不同處理的典型形態(tài)圖。
【具體實施方式】：
[0012] 以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。下列實施例中未 注明具體實驗條件和方法，所采用的技術(shù)手段通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0013] 實施例1:
[0014] 一、毒素蛋白基因的克隆
[0015] 取狄斯瓦螨約60頭，米用TriZolReage