鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原dbp-bsa制備及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原DBP-BSA的制備及用途，具體是 一種用于新興持久性有機(jī)污染物一一塑化劑類(lèi)免疫檢測(cè)的鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原 DBP-BSA及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸酯類(lèi)塑化劑（縮寫(xiě)為PAEs)，又稱(chēng)酞酸酯類(lèi)，是一類(lèi)由鄰苯二甲酸與含 有4-15個(gè)碳的醇發(fā)生費(fèi)歇爾（Fischer)酯化反應(yīng)所形成的酯的重要衍生物的統(tǒng)稱(chēng)。這類(lèi)物 質(zhì)有特殊性氣味，毒性較大，一般情況下?tīng)顟B(tài)為粘稠液體；液態(tài)條件下溫度范圍寬，流動(dòng)性 大，揮發(fā)性低，不溶于水，易溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。這類(lèi)物質(zhì)用途廣泛，它不僅可作為食品包 裝材料、玩具、農(nóng)藥載體、驅(qū)蟲(chóng)劑、潤(rùn)滑劑、乙烯地板和壁紙、去泡劑、清潔劑、醫(yī)用材料（如 人工心臟瓣膜等人工器官、血袋、注射器和膠管）和個(gè)人護(hù)理用品（主要有化妝品、香味品、 指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗發(fā)液）等近千種產(chǎn)品的生產(chǎn)原材料，還常作為塑料增塑劑被 用于改造塑料制品性能。
[0003] 鄰苯二甲酸二丁酯（英文名稱(chēng)：Dimethylphthalate，簡(jiǎn)稱(chēng)DBP)，又名酞酸二丁 酯、避蚊酯、驅(qū)蚊油等，CAS號(hào)為131-11-3,分子式為C1idH1idO4，分子量為194. 19,無(wú)色透明微 黃色油狀液體，稍具芳香味，能與乙醇、乙醚等一般有機(jī)溶劑混溶，不溶于水和石油醚；高度 易燃，遇明火、高熱、氧化劑有燃燒的危險(xiǎn)。該物質(zhì)微毒，對(duì)眼睛粘膜有較強(qiáng)的刺激性；可能 對(duì)胎兒造成傷害，對(duì)水生生物有極高毒性；有損害生育能力的危險(xiǎn)性；吸入、皮膚接觸及吞 食有毒；人體組織內(nèi)可蓄積，從而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)。由于其具備良好的塑膜性、粘著性和 防水性，故常被用于制作醋酸纖維素的薄膜、清漆涂料、透明紙和成模塑料粉等；還可用作 驅(qū)蚊油、聚氟乙烯涂料以及殺蟲(chóng)劑的溶劑 ]。近些年來(lái)，由于頻頻發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在食品、水體中 的含量過(guò)高，因此，該物質(zhì)含量的檢測(cè)便備受關(guān)注。
[0004]目前，關(guān)于鄰苯二甲酸二丁酯的研究主要集中在水體、沉積物、大氣等環(huán)境領(lǐng)域和 生物體的毒性方面，但樣品的檢測(cè)方法方面研究較少。目前對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯的檢測(cè)手 段主要為氣相色譜和高效液相色譜等儀器檢測(cè)方法，這些方法雖然準(zhǔn)確可靠，但對(duì)樣品的 預(yù)處理方法和操作人員的專(zhuān)業(yè)性有很高的要求。正因?yàn)檫@些方法的處理復(fù)雜、耗時(shí)、儀器價(jià) 格昂貴而不適合推廣使用，也不利于在環(huán)境污染事故現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。為克服這些缺點(diǎn)，尋求 一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的分析方法就成為環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的主要研究方向。
[0005] 20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗體的特 異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)的分析技術(shù)。免疫分析具有常規(guī)理化分析技術(shù)無(wú)可比擬的選擇性和 高靈敏性，非常適合復(fù)雜介質(zhì)中痕量組分的分析。因此免疫分析具有的特異性強(qiáng)、靈敏度 高、方法快捷簡(jiǎn)單、分析通量大、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，使得該類(lèi)方法可以滿(mǎn)足簡(jiǎn)單、快速、靈 敏地檢測(cè)持久性有機(jī)污染物的要求。1971年Engvail,VanWeerman等報(bào)道了檢測(cè)體液中 微量物質(zhì)的固相免疫分析技術(shù)，即酶聯(lián)免疫吸附分析法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)。目前，ELISA方法已經(jīng)成為免疫分析方法中重要的組成部分。ELISA方法是 將抗原-抗體之間的免疫反應(yīng)與酶的高效催化特性有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一種免疫分析 方法。其中，以親和素-生物素信號(hào)放大系統(tǒng)為基礎(chǔ)的親和素-生物素化酶聯(lián)免疫吸附分 析法，以生物素標(biāo)記抗體（抗原），并以酶標(biāo)親和素代替ELISA方法中酶標(biāo)抗體。親和素是 卵白蛋白中的一種堿性糖蛋白，分子量約為68kDa。一個(gè)親和素分子由4個(gè)亞單位組成，每 個(gè)亞單位都可以與一個(gè)生物素分子（分子量為244)特異性結(jié)合。生物素與親和素結(jié)合特 異性強(qiáng)，其親和力比抗原抗體反應(yīng)大得多，親和常數(shù)高達(dá)IO15Mi。由于一個(gè)親和素能與4個(gè) 生物素分子結(jié)合，因此在檢測(cè)中可提高被固相結(jié)合酶的數(shù)量，進(jìn)而提高檢測(cè)方法的靈敏度。
[0006] 目前，尚沒(méi)有親和素-生物素化酶聯(lián)免疫吸附分析方法檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯的 相關(guān)報(bào)道。而制備合格的鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原是建立鄰苯二甲酸二丁酯生物免疫 分析檢測(cè)方法的關(guān)鍵，更是建立DBP免疫檢測(cè)分析方法的關(guān)鍵，這將具有重要的應(yīng)用價(jià)值 和理論研究意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種步驟簡(jiǎn)單，速度快，產(chǎn)率高的鄰 苯二甲酸二丁酯人工免疫原（DBP-BSA)的制備方法和用途，為免疫得到特異性抗體和利用 人工抗原、抗體建立免疫檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 第一方面，本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA，結(jié)構(gòu)式如式 (I)所示：
牛血清蛋白BSA偶聯(lián)制備人工免疫原DBP-BSA。
[0012] 優(yōu)選的，所述方法具體包括如下步驟：
[0013] S1、將所述DBP半抗原溶于非質(zhì)子有機(jī)溶劑（包括N，N-二甲基甲酰胺（DMF)或二 甲亞砜）中，形成DBP半抗原溶液；
[0014]S2、向所述DBP半抗原溶液中依次滴加（逐滴加入，就是一滴一滴的滴入，每滴之 間沒(méi)有間隔，DBP半抗原溶液加入速度過(guò)快容易導(dǎo)致重氮鹽制備效率降低）強(qiáng)酸、亞硝酸鈉 溶液（IM)，控制pH為2. 0~3. 0,反應(yīng)結(jié)束后去除未反應(yīng)的亞硝酸鈉，生成重氮鹽溶液；
[0015] S3、將牛血清蛋白BSA溶于0.01~0.05MpH9. 18 (pH過(guò)大或過(guò)小，都不利于本發(fā) 明人工免疫原的制備）硼酸鈉緩沖液中，形成牛血清蛋白溶液；
[0016] S4、在所述重氮鹽溶液加入所述牛血清蛋白溶液，用強(qiáng)堿溶液調(diào)節(jié)pH直至溶液逐 漸呈橙紅色，攪拌進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，即得所述人工免疫原DBP-BSA。
[0017] 本發(fā)明采用重氮化法合成鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原，其反應(yīng)方程式如下：
[0018]
[0020] 優(yōu)選的，所述DBP半抗原、強(qiáng)酸、亞硝酸鈉、牛血清蛋白BSA的摩爾比為1:4~ 5:4 ~5:0. 005 ~0. 008。
[0021] 優(yōu)選的，所述強(qiáng)酸選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸；所述強(qiáng)堿為氫氧化鈉或氫氧化 鉀。
[0022] 優(yōu)選的，步驟Sl中，所述去除未反應(yīng)的亞硝酸鈉是加入尿素以去除未反應(yīng)的亞硝 酸鈉，所述尿素與DBP半抗原的摩爾比為150~160:1。
[0023] 優(yōu)選的，步驟S4中，所述偶聯(lián)反應(yīng)是在0~4°C低溫磁力攪拌下進(jìn)行；所述攪拌時(shí) 間為12~18小時(shí)。所有需要保持蛋白活性的長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)都需要在低溫情況下進(jìn)行，經(jīng)驗(yàn) 表明0~4°C最合適。此外，為充分反應(yīng)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)半抗原與強(qiáng)酸、亞硝酸鈉、尿素、BSA 的摩爾比為1:4:4:150:0. 005時(shí)攪拌反應(yīng)12小時(shí)就可以，當(dāng)半抗原與與強(qiáng)酸、亞硝酸鈉、尿 素、BSA的摩爾比為1:5:5:160:0. 008時(shí)反應(yīng)就需要18小時(shí)。
[0024] 優(yōu)選的，所述步驟S4還包括偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，將上清液裝入透析袋中 透析，離心分離沉淀即得所述人工免疫原DBP-BSA的步驟。
[0025] 優(yōu)選的，所述DBP半抗原是通過(guò)包括如下步驟的方法制備而得：
應(yīng)，生成4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯；
[0027] 以苯或甲苯為溶劑，所述4-硝基鄰苯二甲酸二甲酯和鋅粉、強(qiáng)酸發(fā)生還原反應(yīng)， 生成所述DMP半抗原。
[0028] 具體步驟如下：
[0029]Al、將4-硝基鄰苯二甲酸溶于正丁醇后再逐滴滴加強(qiáng)酸A形成反應(yīng)液a，加熱回流
[0030] A2、將所得式（II)化合物溶于苯或甲苯中形成反應(yīng)液b，先向反應(yīng)液b中加入鋅 粉，再反應(yīng)液b中逐滴加入強(qiáng)酸B溶液，保持還原回流反應(yīng)，至反應(yīng)完全，即得DBP半抗原。 DBP半抗原化學(xué)名稱(chēng)為4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯，分子式：C16H23NO4;分子量：293. 35。
[0031 ] 所述強(qiáng)酸A選自濃鹽酸或濃硫酸；所述強(qiáng)酸B選自濃鹽酸或濃硫酸。
[0032] 優(yōu)選的，所述步驟Al中，4-硝基鄰苯二甲酸、正丁醇、強(qiáng)酸A的摩爾比為為1: (6~ 7) : (0. 5~0. 7)，反應(yīng)溫度為120~130°C，酯化反應(yīng)時(shí)間為6~6. 5小時(shí)；所述步驟A2中， 式（II)化合物與強(qiáng)酸B、苯或甲苯、和鋅粉的摩爾比為I: (21~22) : (560~570) : (18~ 19)(其中苯或甲苯作為基質(zhì)溶液并不參與反應(yīng)），還原反應(yīng)反應(yīng)液b的溫度為25~30°C， 還原反應(yīng)時(shí)間為10~12小時(shí)。
[0033] 理想狀態(tài)下，4-硝基鄰苯二甲酸、正丁醇的摩爾比是1:2,但為了反應(yīng)順利進(jìn)行， 一般正丁醇的用量是4-硝基鄰苯二甲酸的摩爾量的6倍以上，但不能超過(guò)4-硝基鄰苯二 甲酸的摩爾量的7倍；此外，強(qiáng)酸A作為酯化反應(yīng)的催化劑，所用量一般是原料4-硝基鄰苯 二甲酸摩爾量的0. 5倍以上，但不超過(guò)原料4-硝基鄰苯二甲酸摩爾量的0. 7倍；正丁醇在 120°C處于沸騰狀態(tài)，那么130°C更處于沸騰狀態(tài)，反應(yīng)向右進(jìn)行。
[0034] 理想狀態(tài)下，4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯、強(qiáng)酸B和純鋅粉的摩爾比是1:10:10,為 確保反應(yīng)順利向右進(jìn)行，一般純鋅粉的用量是原料4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯摩爾量的18 倍以上，但不能超過(guò)原料4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯摩爾量的19倍；此外，強(qiáng)酸B作為還原 反應(yīng)的強(qiáng)氧化劑，所用量一般是原料純鋅粉摩爾數(shù)的1倍以上，但不超過(guò)原料純鋅粉摩爾 數(shù)的1. 2倍，而非質(zhì)子性有機(jī)溶劑的摩爾數(shù)需要是強(qiáng)氧化劑的摩爾數(shù)的25倍以上，但不超 過(guò)強(qiáng)氧化劑摩爾數(shù)的28倍。
[0035] 優(yōu)選的，所述步驟Al還包括酯化反應(yīng)完全后，蒸餾除去未反應(yīng)的正丁醇和生成的 水，再趁熱將液體倒入冰水中，下層的黃色油狀粗