鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工免疫原及制備、用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工免疫原DEHP-BSA及制備、用 途，具體是一種用于新興持久性有機(jī)污染物一一塑化劑類免疫檢測(cè)的鄰苯二甲酸二（2-乙 基）己酯人工免疫原DEHP-BSA及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸酯類塑化劑（縮寫為PAEs)，又稱酞酸酯類，是一類由鄰苯二甲酸與含 有4-15個(gè)碳的醇發(fā)生費(fèi)歇爾（Fischer)酯化反應(yīng)所形成的酯的重要衍生物的統(tǒng)稱。這類物 質(zhì)有特殊性氣味，毒性較大，一般情況下狀態(tài)為粘稠液體；液態(tài)條件下溫度范圍寬，流動(dòng)性 大，揮發(fā)性低，不溶于水，易溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。這類物質(zhì)用途廣泛，它不僅可作為食品包 裝材料、玩具、農(nóng)藥載體、驅(qū)蟲劑、潤(rùn)滑劑、乙烯地板和壁紙、去泡劑、清潔劑、醫(yī)用材料（如 人工心臟瓣膜等人工器官、血袋、注射器和膠管）和個(gè)人護(hù)理用品（主要有化妝品、香味品、 指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗發(fā)液）等近千種產(chǎn)品的生產(chǎn)原材料，還常作為塑料增塑劑被 用于改造塑料制品性能。
[0003] 鄰苯二甲酸二（2_乙基）己酯（英文名稱：Diethylhexylphthalate，簡(jiǎn)稱DEHP)， 又名酞酸雙（2-乙基己）酯，CAS號(hào)為117-81-7,分子式為C24H38O4，分子量為390. 56,無(wú)色液 體，易溶于乙醇、乙醚和礦物油等。該物質(zhì)強(qiáng)毒性，可能會(huì)造成小孩性別錯(cuò)亂、生殖器短小， 對(duì)動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生致癌反應(yīng)；可在人體中累加，可危害男性生殖能力，促使女性性早熟。該物質(zhì) 主要作為塑膠制品（如：軟性PVC產(chǎn)品、醫(yī)療注射用品、玩具等）的增塑劑而廣泛使用。近 些年來(lái)，中國(guó)臺(tái)灣食品中檢測(cè)到該物質(zhì)含量較高，已對(duì)人體健康構(gòu)成威脅，因此，DEHP在各 類食品中的含量引起了社會(huì)的高度關(guān)注。
[0004] 目前，關(guān)于鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的研究主要集中在水體、沉積物、大氣等 環(huán)境領(lǐng)域和生物體的毒性方面，但樣品的檢測(cè)方法方面研究較少。目前對(duì)鄰苯二甲酸二 (2-乙基）己酯的檢測(cè)手段主要為氣相色譜和高效液相色譜等儀器檢測(cè)方法，這些方法雖 然準(zhǔn)確可靠，但對(duì)樣品的預(yù)處理方法和操作人員的專業(yè)性有很高的要求。正因?yàn)檫@些方法 的處理復(fù)雜、耗時(shí)、儀器價(jià)格昂貴而不適合推廣使用，也不利于在環(huán)境污染事故現(xiàn)場(chǎng)快速檢 測(cè)。為克服這些缺點(diǎn)，尋求一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的分析方法就成為環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng) 域的主要研究方向。
[0005] 20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗體的特 異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)的分析技術(shù)。免疫分析具有常規(guī)理化分析技術(shù)無(wú)可比擬的選擇性和 高靈敏性，非常適合復(fù)雜介質(zhì)中痕量組分的分析。因此免疫分析具有的特異性強(qiáng)、靈敏度 高、方法快捷簡(jiǎn)單、分析通量大、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，使得該類方法可以滿足簡(jiǎn)單、快速、靈 敏地檢測(cè)持久性有機(jī)污染物的要求。1971年Engvail,VanWeerman等報(bào)道了檢測(cè)體液中 微量物質(zhì)的固相免疫分析技術(shù)，即酶聯(lián)免疫吸附分析法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)。目前，ELISA方法已經(jīng)成為免疫分析方法中重要的組成部分。ELISA方法是 將抗原-抗體之間的免疫反應(yīng)與酶的高效催化特性有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一種免疫分析 方法。其中，以親和素-生物素信號(hào)放大系統(tǒng)為基礎(chǔ)的親和素-生物素化酶聯(lián)免疫吸附分 析法，以生物素標(biāo)記抗體（抗原），并以酶標(biāo)親和素代替ELISA方法中酶標(biāo)抗體。親和素是 卵白蛋白中的一種堿性糖蛋白，分子量約為68kDa。一個(gè)親和素分子由4個(gè)亞單位組成，每 個(gè)亞單位都可以與一個(gè)生物素分子（分子量為244)特異性結(jié)合。生物素與親和素結(jié)合特 異性強(qiáng)，其親和力比抗原抗體反應(yīng)大得多，親和常數(shù)高達(dá)IO15Mi。由于一個(gè)親和素能與4個(gè) 生物素分子結(jié)合，因此在檢測(cè)中可提高被固相結(jié)合酶的數(shù)量，進(jìn)而提高檢測(cè)方法的靈敏度。
[0006] 目前，尚沒有親和素-生物素化酶聯(lián)免疫吸附分析方法檢測(cè)鄰苯二甲酸二（2-乙 基）己酯的相關(guān)報(bào)道。而制備合格的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工免疫原是建立鄰苯 二甲酸二（2-乙基）己酯生物免疫分析檢測(cè)方法的關(guān)鍵，更是建立DEHP免疫檢測(cè)分析方法 的關(guān)鍵，這將具有重要的應(yīng)用價(jià)值和理論研究意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種步驟簡(jiǎn)單，速度快，產(chǎn)率高的鄰 苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工免疫原（DEHP-BSA)及制備、用途；為免疫得到特異性抗體 和利用人工抗原、抗體建立免疫檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 第一方面，本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工免疫原DEHP-BSA， 其結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：
白。
[0011] 第二方面，本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯的人工 免疫原DEHP-BSA的制備方法，所述方法包括采用重氮化法將DEHP半抗原
腦P-BSA〇
[0012] 優(yōu)選的，所述方法具體包括如下步驟：
[0013] Sl、將所述DEHP半抗原溶于非質(zhì)子有機(jī)溶劑中，形成DEHP半抗原溶液；
[0014] S2、向所述DEHP半抗原溶液中依次滴加（逐滴加入，就是一滴一滴的滴入，每滴之 間沒有間隔；加入速度過(guò)快容易導(dǎo)致重氮鹽制備效率降低）強(qiáng)酸、亞硝酸鈉溶液（IM)，控制 pH為2. 0~3. 0,反應(yīng)結(jié)束后去除未反應(yīng)的亞硝酸鈉，生成重氮鹽溶液；
[0015] S3、將牛血清蛋白BSA溶于0.01~0.05MpH9. 18 (pH過(guò)高或過(guò)低，都將影響本發(fā) 明的人工免疫原的制備）硼酸鈉緩沖液中，形成牛血清蛋白溶液；
[0016]S4、在所述重氮鹽溶液加入所述牛血清蛋白溶液，用強(qiáng)堿溶液調(diào)節(jié)pH直至溶液逐 漸呈橙紅色，攪拌進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，即得所述人工免疫原DEHP-BSA。
[0017] 本發(fā)明采用重氮化法合成鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工免疫原，其反應(yīng)方程 式如下：
[0018]
[0019] 上述反應(yīng)方程式中，中間產(chǎn)物重氮鹽與牛血清蛋白BSA結(jié)合，偶聯(lián)脫氯，生成了 DEHP人工免疫原。
[0020] 優(yōu)選的，所述DEHP半抗原、強(qiáng)酸、亞硝酸鈉、牛血清蛋白BSA的摩爾比為1:4~ 6:4 ~6:0. 005 ~0. 015。
[0021] 優(yōu)選的，所述強(qiáng)酸選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸；所述強(qiáng)堿為氫氧化鈉或氫氧化 鉀；所述非質(zhì)子性有機(jī)溶劑選自N，N-二甲基甲酰胺或二甲亞砜。
[0022] 優(yōu)選的，步驟Sl中，所述去除未反應(yīng)的亞硝酸鈉是加入尿素以去除未反應(yīng)的亞硝 酸鈉，所述尿素與DEHP半抗原的摩爾比為120~180:1。
[0023] 優(yōu)選的，步驟S4中，所述偶聯(lián)反應(yīng)是在0~4°C低溫磁力攪拌下進(jìn)行；所述攪拌時(shí) 間為12~24小時(shí)。所有需要保持蛋白活性的長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)都需要在低溫情況下進(jìn)行，經(jīng)驗(yàn) 表明0~4°C最合適。此外，為充分反應(yīng)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)半抗原與強(qiáng)酸、亞硝酸鈉、尿素、BSA 的摩爾比為1:4:4:150:0. 005時(shí)攪拌反應(yīng)12小時(shí)就可以，當(dāng)半抗原與與強(qiáng)酸、亞硝酸鈉、尿 素、BSA的摩爾比為1:5:5:160:0. 008時(shí)反應(yīng)就需要24小時(shí)。
[0024] 優(yōu)選的，所述步驟S4還包括偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，將上清液裝入透析袋中 透析，離心分離沉淀即得所述人工免疫原DBP-BSA的步驟。
[0025] 優(yōu)選的，所述DEHP半抗原是通過(guò)包括如下步驟的方法制備而得：
[0027] 以苯或甲苯為溶劑，所述式（II)化合物和鋅粉、強(qiáng)酸發(fā)生還原反應(yīng)，生成所述 DEHP半抗原。
[0028] 具體步驟如下：
[0029]AU將4-硝基鄰苯二甲酸溶于異辛醇（又名2-乙基己醇）后再逐滴滴加強(qiáng)酸A形成反應(yīng)液a，加熱回流反應(yīng)至原料點(diǎn)消失為止，得式（II)化合物；
[0030]A2、將所得式（II)化合物溶于非質(zhì)子性有機(jī)溶劑（苯或甲苯）中形成反應(yīng)液b，先 向反應(yīng)液b中加入鋅粉，再向反應(yīng)液b中逐滴加入強(qiáng)酸B溶液，保持還原回流反應(yīng)，至反應(yīng) 完全，即得DEHP半抗原。DEHP半抗原化學(xué)名稱為4-氨基鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯，分 子式：C24H39NO4，分子量：405. 57。
[0031] 優(yōu)選的，所述步驟Al中，4-硝基鄰苯二甲酸、異辛醇（又名2-乙基己醇）、強(qiáng)酸 A的摩爾比為1: (5~6) :(0.6~0.7)，反應(yīng)溫度為120~150°C，酯化反應(yīng)時(shí)間為5~ 6小時(shí)；所述步驟A2中，式（II)化合物與強(qiáng)酸B、非質(zhì)子性有機(jī)溶劑和鋅粉的摩爾比為 1: (20~25) : (550~580) : (18~20)，其中非質(zhì)子性有機(jī)溶劑作為基質(zhì)溶液并不參與反 應(yīng)，還原反應(yīng)反應(yīng)液b的溫度為25~30°C，還原反應(yīng)時(shí)間為10~12小時(shí)。所述強(qiáng)酸A、B 分別選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸。
[0032] 理想狀態(tài)下，4-硝基鄰苯二甲酸、異辛醇的摩爾比是1:2,但為了反應(yīng)順利進(jìn)行， 一般異辛醇的用量是4-硝基鄰苯二甲酸的摩爾量的5倍以上，但不能超過(guò)4-硝基鄰苯二 甲酸的摩爾量的6倍；此外，強(qiáng)酸作為酯化反應(yīng)的催化劑，所用量一般是原料4-硝基鄰苯 二甲酸摩爾量的0. 6倍以上，但不超過(guò)原料4-硝基鄰苯二甲酸摩爾量的0. 7倍；異辛醇在 120°C處于沸騰狀態(tài)，那么150°C更處于沸騰狀態(tài)，反應(yīng)向右進(jìn)行。
[0033] 理想狀態(tài)下，4-硝基鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯、強(qiáng)酸和純鋅粉的摩爾比是 1:10:10,為確保反應(yīng)順利向右進(jìn)行，一般純鋅粉的用量是原料4-硝基鄰苯二甲酸二（2-乙 基）己酯摩爾量的18倍以上，但不能超過(guò)原料4-硝基鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯摩爾 量的20倍；此外，強(qiáng)酸作為還原反應(yīng)的強(qiáng)氧化劑，所用量一般是原料純鋅粉摩爾數(shù)的1倍以 上，但不超過(guò)原料純鋅粉摩爾數(shù)的1. 2倍，而非質(zhì)子性有機(jī)溶劑的摩爾數(shù)需要是強(qiáng)氧化劑 的摩爾數(shù)的25倍以上，但不超過(guò)強(qiáng)氧化劑摩爾數(shù)的28倍。
[0034] 優(yōu)選的，所述步驟Al還包括酯化反應(yīng)完全后，蒸餾除去未反應(yīng)的異辛醇和生成的 水，再趁熱將液體倒入冰水中，下層的黃色油狀粗品用10%Na2CO3溶液洗滌至水層呈無(wú)色， 重結(jié)晶DEHP半抗原中間體的步驟。
[0035] 優(yōu)選的，所述步驟A2還包括還原反應(yīng)完全后，用冰水和強(qiáng)堿溶液以