兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種多克隆抗體，尤其涉及兔抗牛乳 鐵蛋白多克隆抗體，本發(fā)明進(jìn)一步涉及該兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體在定性和定量檢測(cè) 乳、乳制品或乳腺中乳鐵蛋白中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，人們對(duì)乳品質(zhì)的要求越來(lái)越高，乳蛋白作為衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)， 其合成的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控已經(jīng)成為奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。乳鐵蛋白也稱為乳運(yùn)鐵蛋白 (lactoferrin，Lf)，是牛奶中重要生物活性物質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)鐵吸收，廣譜抗細(xì)菌感染， 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，抗氧化、抗癌、抗病毒等多種功效。乳鐵蛋白在人初乳中含量較高，濃 度為6-8mg/mL;奶牛初乳中濃度為l-2mg/mL，而在常乳中的含量較低，人常乳中濃度僅為 l-2mg/mL，奶牛常乳中濃度僅為0. 02-0. 35mg/mL。由于人乳來(lái)源有限，因此牛乳即成為人們 獲取乳鐵蛋白的最直接途徑。為檢測(cè)乳與乳制品中乳鐵蛋白的含量，有效降低牛奶加工過(guò) 程中造成的損失，需要建立一種快速、準(zhǔn)確的測(cè)定生鮮乳及乳制品中乳鐵蛋白含量的方法。
[0003]截至目前，乳鐵蛋白的定性和定量檢測(cè)方法主要包括隨機(jī)免疫擴(kuò)散法（RID)、放射 免疫分析法（RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)方法、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電 泳法（SDS-PAGE)以及高效液相色譜法（HPLC)等。其中，RID和RIA方法檢測(cè)范圍有限，準(zhǔn) 確性差，且存在一定放射危害。SDS-PAGE法相對(duì)耗時(shí)較長(zhǎng)，且不易于準(zhǔn)確定量，不宜檢測(cè)大 批量樣品。HPLC法雖可準(zhǔn)確定量，但其檢測(cè)對(duì)象有限，僅適合檢測(cè)液態(tài)奶和奶粉樣品，且對(duì) 樣品純度有一定要求，僅適用于高純度樣品測(cè)定，樣品前處理過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，同時(shí)儀器設(shè)備 昂貴，且對(duì)于儀器的操作技能要求較高。
[0004] 相比之下，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)方法是檢測(cè)特定蛋白的有效方法，具有快 速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合SDS-PAGE及Western-blot，可用于針對(duì)特定 抗原的定性和定量檢測(cè)。但是，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法檢測(cè)生鮮乳及乳制品中的乳鐵 蛋白含量，需要用到相應(yīng)的乳鐵蛋白抗體。
[0005] 現(xiàn)有的乳鐵蛋白多克隆抗體多不同程度的存在效價(jià)較低、純度不高、特異性不強(qiáng) 等缺陷，限制了其在檢測(cè)生鮮乳及乳制品中的乳鐵蛋白含量中的應(yīng)用，有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種效價(jià)高、純度高、特 異性強(qiáng)的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體，為定量檢測(cè)乳及乳制品中以及奶牛乳腺中合成的乳 鐵蛋白提供有效研究材料。
[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 一種兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體，其通過(guò)以下方法制備得到：
[0009] (1)將乳鐵蛋白與免疫佐劑混合，得到含有復(fù)合佐劑的乳鐵蛋白溶液；
[0010] (2)用含有復(fù)合佐劑的乳鐵蛋白溶液免疫兔，獲取抗血清；離心，取上清，得到抗 血清，備用；
[0011] (3)將抗血清依次用免疫磁珠法和蛋白A親和層析法進(jìn)行純化，得到純化的兔抗 牛乳鐵蛋白多克隆抗體。
[0012] 其中，步驟（1)中將乳鐵蛋白與CpG佐劑溶于PBS中得到混合溶液，再與Al(OH)3 混合，得到含有復(fù)合佐劑的乳鐵蛋白溶液；優(yōu)選的，將0. 5mg乳鐵蛋白與50ygCpG佐劑溶 于ImLPBS中得到混合溶液；將混合溶液與Al(OH)^M1:5的體積比混合，得到含有復(fù)合 佐劑的乳鐵蛋白溶液。
[0013] 所述的免疫方式包括：采用皮下多點(diǎn)注射法的方式將含有復(fù)合佐劑的乳鐵蛋白溶 液免疫新西蘭白兔，免疫的次數(shù)為4次；其中，第1次免疫4周后，進(jìn)行第2次免疫；以后每 2周重復(fù)免疫1次，進(jìn)行第3次和第4次免疫；第4次免疫后的第7天收集抗血清。為了達(dá) 到更好的技術(shù)效果，在第1次免疫時(shí)，每只兔免疫500yg乳鐵蛋白；第2次、第3次和第4 次免疫時(shí)，每只兔每次免疫250yg乳鐵蛋白。
[0014] 將抗血清通過(guò)不同的方式進(jìn)行純化，所獲得的乳鐵蛋白多克隆抗體的純度存在較 大的差異；本發(fā)明通過(guò)篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用飽和硫酸銨法純化抗血清所獲得的乳鐵蛋白多 克隆抗體的純度僅為62%，采用免疫磁珠法聯(lián)合蛋白A親和層析法純化抗血清所獲得的乳 鐵蛋白多克隆抗體的純度達(dá)到87%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于了飽和硫酸銨法這種純化方式；因此， 本發(fā)明優(yōu)選采用免疫磁珠法聯(lián)合蛋白A親和層析法純化抗血清。
[0015] 所述免疫磁珠法純化抗血清包括：將磁珠加入到離心管中，在磁力分離器上放置 吸去上清液，加入稀釋的抗血清，靜置，吸去上清液；重懸磁珠，重復(fù)清洗，吸去上清液；加 入枸櫞酸鈉緩沖液，渦旋震蕩，靜置，吸取上清液，重復(fù)清洗，將所得上清液混合，得到純化 后抗體；
[0016] 優(yōu)選的，取100yL磁珠加入2mL離心管中，在磁力分離器上放置3min后吸去上清 液，加入300yL按照1:100的比例稀釋的抗血清，4°C條件下保持傾斜緩慢旋轉(zhuǎn)lOmin，而 后靜置3min后吸去上清液，用pH= 7. 4的PBS重懸磁珠，重復(fù)清洗3遍后，離心管再次在 磁力分離器上放置3min吸去上清液，加入pH3.O的0.lmol/L枸櫞酸鈉緩沖液，渦旋震蕩 3min，然后再在磁力分離器上放置2min后吸取上清液，重復(fù)清洗3遍，將所得上清液混合， 得到純化后抗體。
[0017] 所述將抗血清用蛋白A親和層析法進(jìn)行純化的方式包括：上樣前首先用結(jié)合/洗 滌緩沖液平衡蛋白A-瓊脂糖-4B并裝柱，洗去所含蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，待流出洗脫液0D2SQ〈0. 02 時(shí)；將結(jié)合/洗滌緩沖液稀釋后的抗血清加入柱中，待全部血清樣品進(jìn)入柱床后，用結(jié)合/ 洗滌緩沖液沖洗柱子，待洗脫液0D2S(]〈0. 02時(shí)，用pH= 2. 8的3. 5 %冰乙酸洗脫，將含有抗 體的洗脫液收集到含平衡緩沖液的容器中，濃縮，即得；
[0018] 優(yōu)選的，所述的結(jié)合/洗滌緩沖液為含有IMNaCl的0.lmol/LTriS-HCl緩沖液， 其pH= 8. 6 ;
[0019] 為了達(dá)到更好的效果，上樣前首先用結(jié)合/洗滌緩沖液平衡蛋白A-瓊脂糖-4B并 裝柱，以lmL/min流速洗去雜質(zhì)；待流出洗脫液0D2SQ〈0. 02時(shí)，將結(jié)合/洗滌緩沖液稀釋后 的血清樣本（1:4,v/v)加入柱中，待全部血清樣品進(jìn)入柱床后，用結(jié)合/洗滌緩沖液沖洗柱 子并使緩沖液流出速度約1111171^11，待洗脫液00 28?！?.02時(shí)，用？11 = 2.8的3.5%冰乙酸洗 脫，將含有抗體的洗脫液收集到含平衡緩沖液的容器中以中和洗脫液PH至7. 3 ;
[0020] 所述的濃縮優(yōu)選用IOkDa超濾管進(jìn)行濃縮。
[0021] 本發(fā)明將所制備的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體和現(xiàn)有的商品化抗牛乳鐵蛋白多 克隆抗體（美國(guó)Sigma公司）進(jìn)行了效價(jià)比較，本發(fā)明的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體效價(jià) 為1 :128000,而商品化抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體（美國(guó)Sigma公司）效價(jià)僅為1 :32000。
[0022] Western-blot結(jié)果顯示本發(fā)明純化后的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體能夠特異性 識(shí)別乳鐵蛋白。ELISA試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，本發(fā)明制備的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體僅對(duì)乳鐵蛋 白專一性結(jié)合，而與酪蛋白無(wú)結(jié)合反應(yīng)，表明其具有良好的特異性。
[0023] 本發(fā)明通過(guò)給新西蘭大白兔免疫乳鐵蛋白獲得其抗血清，通過(guò)免疫磁珠法和蛋白 A親和層析法對(duì)抗血清進(jìn)行純化，得到純度和效價(jià)高的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體，其抗體 濃度為11. 〇2mg/mL，其抗體效價(jià)為1:128000。本發(fā)明兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體能夠特異 性識(shí)別乳鐵蛋白，僅對(duì)乳鐵蛋白專一性結(jié)合，而與酪蛋白無(wú)結(jié)合反應(yīng)，表明其具有良好的特 異性。
[0024] 本發(fā)明所制備的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體與奶牛乳腺組織中提取的乳鐵蛋白 具有反應(yīng)性，同時(shí)對(duì)奶粉中的乳鐵蛋白也有特異反應(yīng)性，可用于檢測(cè)奶牛乳腺組織和奶制 品中的乳鐵蛋白。
[0025] 因此，本發(fā)明提供了將所制備的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體應(yīng)用于定性或定量檢 測(cè)乳制品或乳腺中乳鐵蛋白；譬如，將本發(fā)明所制備的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體作為檢 測(cè)抗體采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)方法結(jié)合SDS-PAGE及Western-blot，對(duì)乳制品或乳 腺中的乳鐵蛋白進(jìn)行定性或定量檢測(cè)，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。
[0026] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種定性或定量檢測(cè)乳鐵蛋白的ELISA試劑盒，包括：檢測(cè) 抗體、抗體稀釋液、包被緩沖液、封閉液、PBS緩沖液、洗滌緩沖液和終止液；其中，所述的檢 測(cè)抗體是本發(fā)明制備的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體。
[0027] 所述包被緩沖液優(yōu)選是：溶劑為超純水，溶質(zhì)為Na2COjPNaHCO3，所述溶質(zhì)Na2CO3 和NaHCO3在包被緩沖液中的濃度為0. 05M，pH為9. 6;
[0028] 所述封閉液優(yōu)選是：溶劑為超純水，溶質(zhì)為卵清白蛋白，所述溶質(zhì)卵清白蛋白在封 閉緩沖液中的濃度為1% ;
[0029]所述PBS緩沖液優(yōu)選是：溶劑為超純水，溶質(zhì)為NaCl、KCl、KH2POjPNa2HP04，所述 溶質(zhì)NaCl、KCl、KH2POjPNa2HP04在所述PBS緩沖液中的濃度分別為8g/L、0. 2g/L、0. 2g/L 和 0? 46g/L，pH值為 7. 4;
[0030] 所述洗滌緩沖液優(yōu)選是：溶劑為所述PBS緩沖液，溶質(zhì)為吐溫-20,所述溶質(zhì)吐 溫-20在所述洗滌緩沖液中的濃度為50mL/L;
[0031] 所述抗體稀釋液優(yōu)選是：溶劑為所述PBS緩沖液，溶質(zhì)為吐溫-20和明膠，所述溶 質(zhì)吐溫-20和明膠在所述抗體稀釋液中的濃度分別為10mL/L和0.OlM;
[0032] 所述終止液優(yōu)選是2M的硫酸水溶液；
[0033] 所述底物溶液A優(yōu)選為：溶劑為超純水，溶質(zhì)為過(guò)氧化氫脲、Na2HPO4、檸檬酸和 吐溫-20,過(guò)氧化氫脲、Na2HPO4、檸檬酸和吐溫-20在所述底物溶液A中濃度分別為lg/L、 14. 2g/L、9. 42g/L和 0?lmL/L;
[0034] 所述底物溶液B優(yōu)選為：溶劑為超純水，溶質(zhì)為四甲基聯(lián)苯胺、檸檬酸和硫代硫酸 鈉，四甲基聯(lián)苯胺、檸檬酸和硫代硫酸鈉在所述底物溶液B中的濃度分別為0. 4g/L、l. 83g/ L和 0.lg/L。
[0035] 本發(fā)明抗體可以特異性結(jié)合乳制品中以及乳腺組織中的乳鐵蛋白。本發(fā)明以所 制備的兔抗牛乳鐵蛋