抗菌星型聚多肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗菌材料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及抗菌星型聚多肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素類(lèi)抗菌劑的濫用會(huì)導(dǎo)致超級(jí)抗藥菌的生成，且會(huì)隨著皮膚滲透或血液循環(huán) 到未被細(xì)菌感染的器官，從而造成毒副作用。因此，如何利用新型抗菌劑替代傳統(tǒng)的抗生素 類(lèi)抗菌劑一直以來(lái)都是全球性的科學(xué)課題。
[0003] 二十世紀(jì)九十年代，生物學(xué)家在用微生物誘導(dǎo)天蠶蛹時(shí)發(fā)現(xiàn)天蠶蛹的免疫系統(tǒng)產(chǎn) 生了一種多肽類(lèi)物質(zhì)，該多肽物質(zhì)具有殺菌活性?？茖W(xué)家命名此多肽為天蠶素（Cecmpins)， 天蠶素作為世界上第一個(gè)抗菌肽正式被人們所認(rèn)識(shí)。天然抗菌肽的氨基酸殘基數(shù)目一般為 15-50個(gè)，并且具有加熱后穩(wěn)定性高，在水中溶解性較好等優(yōu)點(diǎn)。天然抗菌肽受到人們的關(guān) 注正是因?yàn)樗鼈兙哂械莫?dú)特功能，比如有些天然抗菌肽能夠?qū)?xì)菌、病毒、真菌、原生動(dòng)物 等具有較強(qiáng)的抑制作用，而且部分天然抗菌肽在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)又對(duì)真核細(xì)胞毒副性較 小。但目前天然抗菌肽依然存在來(lái)源有限（天然提取資源有限，難以產(chǎn)業(yè)化）、成本高、提取 工藝復(fù)雜、容易被酶降解等問(wèn)題。
[0004] 人工廣譜高分子抗菌劑是一種帶有大量表面正電荷的高分子，它可以通過(guò)靜電相 互作用靶向地與細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)合并插入細(xì)胞膜內(nèi)，造成細(xì)菌細(xì)胞膜的解體。由于高分子 抗菌劑直接作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜表面而并非像傳統(tǒng)的抗生素一樣作用于細(xì)菌的DNA，所以 其不會(huì)造成超級(jí)抗藥菌的產(chǎn)生（WordNotesonAntibiotics, 2009，V〇1,No. 4)，且對(duì)于野 生菌種和耐藥性菌種均有效果。另外，由于人體的正常細(xì)胞表面的負(fù)電荷要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于細(xì)菌 表面的負(fù)電荷，因此其不會(huì)破壞人體的正常細(xì)胞。同時(shí)，高分子抗菌劑不會(huì)通過(guò)滲透作用進(jìn) 入皮膚或者細(xì)胞膜內(nèi)，因此無(wú)毒副作用，是一種理想的傳統(tǒng)抗生素替代品。
[0005] 非線(xiàn)形聚丙烯酸酯類(lèi)聚合物，由于其較大的表面正電荷密度以及其較高的分子鏈 柔性，更加容易與細(xì)胞膜特異性結(jié)合并使細(xì)菌細(xì)胞膜解體，是一種高效靶向的廣譜高分子 抗菌劑。且其合成方法簡(jiǎn)單，有望被大規(guī)模生產(chǎn)。因此，提供一種星型聚多肽及其制備方法 和其用作抗菌劑的用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種星型聚多肽、其制備方法及用途。以NCA聚合為手段， 合成三臂星形聚多肽，相比于其它方法如固相合成法或用微生物合成法，其施行簡(jiǎn)單，提純 方便，且其產(chǎn)率高達(dá)到96%。和已有的產(chǎn)品相比價(jià)格低，因此是目前合成三臂星形聚多肽最 行之有效的方法。本方法合成的三臂星形聚多肽分子量較窄，PDI(分子量分布）只有1.1， 合成的星形聚多肽與天然多肽分子結(jié)構(gòu)基本一致，可作為生物醫(yī)用級(jí)抗菌劑給人類(lèi)使用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種三臂星型聚多肽，其結(jié)構(gòu)如式I所示
[0009]
[0012]n= 50 ~200。
[0013]星形聚多肽類(lèi)聚合物，由于其表面正電荷密度較大以及具有較好的生物相容性， 因此更容易與細(xì)菌的細(xì)胞膜特異性結(jié)合并使細(xì)菌細(xì)胞膜解體，是一種高效靶向的廣譜高分 子抗菌劑。所合成的聚多肽，與天然多肽分子結(jié)構(gòu)基本一致，可作為醫(yī)用級(jí)抗菌劑給人類(lèi)使 用。
[0014] 現(xiàn)今合成星形聚合物的方法主要有核優(yōu)先法和臂優(yōu)先法。而這些合成方法往往需 要通過(guò)活性聚合來(lái)實(shí)現(xiàn)，陰離子聚合、陽(yáng)離子聚合及活性自由基聚合均可合成出分子結(jié)構(gòu) 可控的星形聚合物。
[0015]N-羧基-a-氨基酸酐聚合方法（NCA聚合方法）是生物化學(xué)方面非常重要的一個(gè) 反應(yīng)，是現(xiàn)今為止唯一一種通過(guò)一步法即可得到聚氨基酸的反應(yīng)。這種方法相比于現(xiàn)今常 用的固相合成法，其合成成本大大降低；相比于微生物合成法，其避免了復(fù)雜的提純過(guò)程。 NCA聚合機(jī)理上屬于陰離子開(kāi)環(huán)聚合，可以通過(guò)四種模式引發(fā)反應(yīng)，即伯胺引發(fā)、叔胺引發(fā)、 金屬化配位合物引發(fā)已經(jīng)硅-氮化合物引發(fā)。其中伯胺引發(fā)的NCA聚合符合活性聚合特 征，可以使得到的聚氨基酸帶有末端基團(tuán)，方便聚多肽鏈的修飾，并可通過(guò)末端基團(tuán)進(jìn)行復(fù) 雜高分子鏈的構(gòu)筑，是一種合成聚多肽的反應(yīng)。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的三臂星型聚多肽，其結(jié)構(gòu)如式II 所示
[0017]
[0018] 其中，n= 50 ~200。
[0019] 本發(fā)明還提供了所述三臂星型聚多肽的制備方法，取炔丙胺、芐基氨基甲酸酯保 護(hù)的N-羧基-a-賴(lài)氨酸酐與DMSO發(fā)生聚合反應(yīng)，在水中沉淀，獲得第一產(chǎn)物；取所述中間 產(chǎn)物、DMF、三功能度疊氮核、CuBr、五甲基二亞乙基三胺通氮?dú)夥磻?yīng)，在水中沉淀，獲得第二 產(chǎn)物，通過(guò)鈀碳催化進(jìn)行還原加氫反應(yīng)，透析、除水、真空干燥。
[0020] 具體為：
[0021] 當(dāng)采用臂優(yōu)先法時(shí)，其特征為：利用單功能NCA引發(fā)劑，首先通過(guò)NCA聚合的手段 合成末端帶有炔基的線(xiàn)形聚合物，再通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，利用聚多肽末端的炔基與三功能 度的疊氮核核進(jìn)行耦合，合成分子結(jié)構(gòu)可控的三臂星形聚多肽，最后通過(guò)鈀碳催化加氫法 脫掉芐基氨基甲酸酯的保護(hù)。
[0022] 反應(yīng)方程式如下：
[0023]
[0026] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的三臂星型聚多肽的制備方法 中，所述第一產(chǎn)物、DMF:三功能度疊氮核：CuBr:五甲基二亞乙基三胺按照物質(zhì)的量比為 1:(50 ~200):0? 1:0. 3:0. 3。
[0027] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的三臂星型聚多肽的制備方法中， 所述聚合反應(yīng)在氮?dú)猸h(huán)境下發(fā)生。
[0028] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的三臂星型聚多肽的制備方法中， 所述聚合反應(yīng)的時(shí)間為60h~70h;所述通氮?dú)夥磻?yīng)的時(shí)間為2~4h。
[0029] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的三臂星型聚多肽的制備方法中， 所述第二產(chǎn)物與氫氣的物質(zhì)的量的比為1:3000。
[0030] 本發(fā)明還提供了所述制備方法制得的三臂星型聚多肽。
[0031] 本發(fā)明還提供了所述三臂星型聚多肽在制備抗菌劑中的應(yīng)用。
[0032] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的三臂星型聚多肽的應(yīng)用中，所述 抗菌劑用于抑制細(xì)菌。
[0033] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的三臂星型聚多肽的應(yīng)用中，所述 抗菌劑用于抑制革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽(yáng)性菌。
[0034] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的三臂星型聚多肽的應(yīng)用中，所述 革蘭氏陰性菌為大腸桿菌。大腸桿菌可以為普通野生大腸桿菌，還可以為抗藥性大腸桿菌。
[0035] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的三臂星型聚多肽的應(yīng)用中，所述 革蘭氏陽(yáng)性菌為金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌可以為普通野生金黃色葡萄球菌，還可 以為抗藥性金黃色葡萄球菌。
[0036] 本發(fā)明提出基于臂優(yōu)先法（arm-first法）聚多肽類(lèi)人工光譜抗菌劑的制備方法 及其抗菌用途。并以NCA聚合為手段，通過(guò)調(diào)控引發(fā)劑和單體的比例可控合成出生物醫(yī)用 級(jí)的聚多肽類(lèi)的人工高分子廣譜抗菌劑。提出一種可取代傳統(tǒng)抗生素的新型高分子抗菌 劑。利用側(cè)基帶有氨基的三臂的星形聚合物作為高分子抗菌劑，可以靶向進(jìn)攻細(xì)菌細(xì)胞膜 卻不破壞人體正常細(xì)胞，且具有非常好的抗菌效果。以解決目前現(xiàn)有的高分子抗菌劑往往 是一些天然的多肽，其產(chǎn)量低、價(jià)格高，且在人體中易被酸或蛋白酶水解，因此往往難以被 大規(guī)模應(yīng)用的問(wèn)題。
[0037] 本發(fā)明制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0038] 1.本方法采用臂優(yōu)先法（arm-first法），并以NCA聚合為手段，合成三臂星形聚 多肽，相比于其它方法如固相合成法或用微生物合成法，其施行簡(jiǎn)單，提純方便，且其產(chǎn)率 高（達(dá)到95%)，中國(guó)專(zhuān)利（CN1635010A)報(bào)道的一種高分子抗菌劑只有50%-80%的產(chǎn)率。 和已有的產(chǎn)品相比價(jià)格低，因此是目前合成三臂星形聚多肽最行之有效的方法。
[0039] 2.本方法合成的三臂星形聚多肽分子量較窄，roi(分子量分布）只有1. 1，合成 的星形聚多肽與天然多肽分子結(jié)構(gòu)基本一致，可作為生物醫(yī)用級(jí)抗菌劑給人類(lèi)使用。
[0040] 本發(fā)明制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比還具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0041] 1.與現(xiàn)有的天然高分子抗菌劑相比，人工合成的聚多肽類(lèi)產(chǎn)品產(chǎn)量高、價(jià)格低、更 易于合成。
[0042] 2.非線(xiàn)形的分子結(jié)構(gòu)可以提供更加高的表面正電荷密度，有利于高分子抗菌劑與 細(xì)菌表面的細(xì)胞膜特異性結(jié)合，從而大幅提高抗菌效率。
[0043] 3.本產(chǎn)品具有廣譜抗菌型，對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌均有效。
[0044] 4.本產(chǎn)品直接使細(xì)菌細(xì)胞膜解體，不會(huì)產(chǎn)生抗藥的超級(jí)細(xì)菌，且對(duì)于耐藥菌種有 很好的效果。
[0045] 5.本產(chǎn)品分子結(jié)構(gòu)與天然多肽極為類(lèi)似，不會(huì)隨人體皮膚毛孔和血液循環(huán)滲透入 人體正常細(xì)胞，對(duì)人體毒副作用極小。
【附圖說(shuō)明】
[0046] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0047] 圖1示本發(fā)明制備的三臂星形聚多肽的反應(yīng)方程式；
[0048] 圖2示本發(fā)明實(shí)施例1中的三臂星形聚多肽核磁共振氫譜圖；
[0049] 圖3示本發(fā)明實(shí)施例1中芐基氨基甲酸酯保護(hù)的星形聚多肽凝膠滲透色譜曲線(xiàn)； 縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，沒(méi)有單位；分子量為15000,PDI分布為I. 1說(shuō)明可控合成比較有效果；
[0050] 圖4示本發(fā)明提供的三臂星形聚多肽的濃度和殺菌效果曲線(xiàn)；在產(chǎn)物濃度大于 4yg/ml時(shí)，對(duì)普通野生大腸桿菌殺滅為99. 99%，對(duì)抗藥性大腸桿菌殺滅為99% ;