馬克思克魯維酵母菌及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酵母菌，尤其涉及一種具有高分泌性能和高生物量的馬克思克魯 維酵母菌、及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前已知的酶制劑有100多種，常用的有30多種，廣泛用于食品、發(fā)酵、制革、紡 織、日用化工、醫(yī)藥等工業(yè)。在我國規(guī)定可用于食品工業(yè)的有15種。
[0003] 工業(yè)酶制劑來源于生物，但因通常使用的不是酶的純品，制品中的有關(guān)組分（如 微生物的某些代謝產(chǎn)物，甚至是有害的物質(zhì)）有可能在使用時隨著食品而被帶入，從而影 響人體健康。美國、加拿大、歐盟、澳大利亞、新西蘭、日本等國均規(guī)定酶制劑必須經(jīng)過嚴格 的安全性評價，批準后才能生產(chǎn)銷售。因此，利用微生物生產(chǎn)酶制劑時，其生產(chǎn)方法和培養(yǎng) 條件都應保證是在受控條件下發(fā)酵，以保證所用的微生物不致成為有毒物質(zhì)和其他有害物 質(zhì)的來源。
[0004] 酵母（或：酵母菌）是一類單細胞真核生物，具有生長旺盛、培養(yǎng)簡單和其獨有的 一些特性，它已被發(fā)展成為表達外源基因的重組表達系統(tǒng)。酵母作為單細胞生物一方面在 操作和生產(chǎn)上具有細菌表達系統(tǒng)的特點，另一方面又具有真核細胞對翻譯后蛋白的加工及 修飾過程。如：二硫鍵的正確形成、前體蛋白的水解加工、糖基化作用等。
[0005] 利用酵母表達系統(tǒng)表達外源蛋白的宿主包括：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維亞酵母（KluyveromycesIactis)、粟酒裂殖糖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、解脂耶羅維亞酵母（YarrowiaIipolytica)、西方許旺氏 酵母（Schwanuiomycesoccidentalis)、多形漢遜酵母（Hansenulapolymorpha)和巴氏畢 赤酉孝母（Pichiapastoris) 〇
[0006] 克魯維酵母安全不產(chǎn)生內(nèi)毒素，營養(yǎng)要求極其簡單、生長旺盛、生物量大、生長溫 度適應范圍廣（25 - 46°C)等優(yōu)點，是用于發(fā)酵工業(yè)的重要微生物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本申請?zhí)峁┝艘环N具有高分泌性能和高生物量的馬克思克魯維酵母菌。
[0008] 本發(fā)明提供的馬克思克魯維酵母菌（Kluyveromycesmarxianus;K.marxianus)， 保藏號為CGMCCNo. 10621(在本發(fā)明下述內(nèi)容中，也可以稱為馬克斯克魯維酵母F頂-1、 K.marxianusFIM-1 或KluyveromycesmarxianusFIM-1)〇
[0009] 本發(fā)明所述的馬克思克魯維酵母菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心；保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所； 保藏日期為2015年3月13日。
[0010] 本發(fā)明馬克思克魯維酵母菌，株菌落為圓形，呈乳白色，邊緣整齊；酵母菌呈橢圓 形，大小約為4-8ym，出芽生殖，單個、兩個或多個系成串粘連。
[0011] 本發(fā)明馬克思克魯維酵母菌，發(fā)酵分泌內(nèi)切菊粉酶，并且在以葡萄糖為碳源條件 下菊粉酶產(chǎn)量大于葡萄糖、菊粉混合碳源條件下的產(chǎn)量。
[0012] 本發(fā)明第二個方面是提供一種馬克思克魯維酵母菌發(fā)酵方法，包括：
[0013] 提供馬克思克魯維酵母菌CGMCCNo. 10621;
[0014] 在氮源和碳源存在條件下進行發(fā)酵；
[0015] 收集菊粉酶。
[0016] 其中，在所述發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶方法中，所述碳源優(yōu)選為至少包括葡萄糖。
[0017] 其中，在所述發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶方法中，所述氮源優(yōu)選為至少包括酵母提取物。
[0018] 其中，在所述發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶方法中，發(fā)酵時間優(yōu)選為48-96小時。
[0019] 其中，在所述發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶方法中，發(fā)酵溫度優(yōu)選為25-38 °C，更優(yōu)選為 28-37 °C，更優(yōu)選為30-36 °C，更優(yōu)選為33-35 °C。
[0020] 其中，在所述發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶方法中，菌株接種量優(yōu)選為0. 05 % -5 %，更優(yōu)選為 0? 1% -4. 5%，更優(yōu)選為 0? 5% -4%，更優(yōu)選為 1% -3%，如L5%、2%。
[0021] 其中，所述方法可以是用于馬克思克魯維酵母菌的高生物量發(fā)酵。
[0022] 其中，所述方法可以是用于生產(chǎn)菊粉酶。
[0023] 本發(fā)明所提供的馬克思克魯維酵母菌，相比于ATCC8585、ATCC26548等現(xiàn)有克魯 維酵母，具有更高的分泌蛋白的能力和更高的生物量，可用于生產(chǎn)酶制劑，并且可以用來構(gòu) 建重組蛋白表達系統(tǒng)。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明馬克思克魯維酵母菌分泌蛋白能力，泳道I:K.marxianusFIM-I;泳 道2 :K.marxianusATCC26548 ;泳道3 :K.IactisATCC8585 ;泳道M;蛋白Marker;泳道4-8 為那曲酸奶分離的不同的K.marxianus酵母菌株；
[0025] 圖2為本發(fā)明馬克思克魯維酵母菌細胞形態(tài)；
[0026]圖3為本發(fā)明馬克思克魯維酵母菌高生物量發(fā)酵結(jié)果；
[0027] 圖4為葡萄糖為碳源的條件下（A)、葡萄糖和菊粉混合物為碳源條件下（B)， K.marxianusF頂-1分泌的菊粉酶產(chǎn)量對比，通道1-7依次為發(fā)酵24、48、72、96、120、144、 168小時條件下的菊粉酶產(chǎn)量；
[0028]圖5為本發(fā)明馬克思克魯維酵母菌發(fā)酵罐發(fā)酵菊粉酶的產(chǎn)量變化曲線；
[0029]圖6為本發(fā)明馬克思克魯維酵母菌發(fā)酵罐發(fā)酵菊粉酶的蛋白電泳分析，通道1-7 依次為發(fā)酵10、23、27、32、36、48、57小時條件下的菊粉酶產(chǎn)量。
【具體實施方式】
[0030] 樣品采集和酵母分離:
[0031] 2014年8月從西藏那曲地區(qū)采集不同的酸奶樣本。
[0032] 取酸奶樣本lg，用50ml的無菌水稀釋，然后用無菌水進行10倍、100倍、1000倍 和10000倍稀釋，取100y1稀釋液涂布于酵母固體培養(yǎng)基YNB(無氨基酵母氮源；Yeast NitrogenBasewithoutAminoAcids)+1 %菊粉平板上，30°C培養(yǎng) 3-4 天后形成克隆。
[0033]
[0034] 將酸奶樣本中分離到的酵母菌以及從ATCC購買兩株克魯維酵母菌株 KluyveromycesIactis(保藏號：ATCC8585)和K.marxianus(保藏號：ATCC26548)，在含 1%酵母提取物（YeastExtract)和2%的葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30°C發(fā)酵培養(yǎng)120h后離心 收集發(fā)酵上清，然后采用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)檢測各株 酵母分泌蛋白的能力。
[0035] 其中發(fā)現(xiàn)：一株酵母Fm-I具有高分泌蛋白能力（如圖1所示），分泌蛋白的大小 約90kDa左右。
[0036]菌株鑒宙
[0037] 酵母菌F頂-1的菌種的鑒定采用了18srDNA方法。
[0038]通過 18SrDNA通用引物NSl(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和 NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)，以提取酵母菌F頂-1的基因組為模板，進行PCR擴增與測序， 獲得了 18srDNA序列如SEQIDNO. 1所示，與GenBank中的已知序列進行比對后，發(fā)現(xiàn)獲 得的酵母菌FIM-1的18srDNA序列與K.marxianusNBRC1777的序列相似度為100%