用于生產吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種用于生產吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株 及其用途。
【背景技術】
[0002] 我國作為一個人口和糧食大國，近幾十年來為了解決糧食問題，大量使用化學農 藥來預防和控制病蟲害，但也對環(huán)境造成了極大的污染，危害人類健康。據(jù)統(tǒng)計，我國農田 的平均農藥使用量是世界平均水平的2~5倍（章建森.我國農藥平均用量比世界高2. 5 至5倍.農藥市場信息，2011 (7) :7)。化學農藥的大量使用使許多病蟲產生了嚴重的抗藥 性，防治效果不斷降低。與化學農藥相比，生物農藥具有一些明顯的產業(yè)優(yōu)勢，主要表現(xiàn)為 以下幾點：(a)可采用農副產品為生產原料，原料來源豐富且價格低廉；(b)生產設備通用 性較好，可生產多個品種；（c)產品具有較大的開發(fā)潛力，通過基因技術和生物工程技術實 現(xiàn)產品的再開發(fā)；（d)投資風險相對較小。因此，生物農藥在農藥市場的地位和作用愈來愈 重要，越來越受到世界各國政府的重視。
[0003] 天然吩嗪化合物是一類典型的微生物次級代謝產生的抗生素。由于吩嗪環(huán)的存 在，幾乎所有的吩嗪類化合物都具有一定的氧化還原活性，能夠與細胞內的活性成分發(fā)生 作用，進而積累多種超氧化物和過氧化物，因此具有廣譜的抑制植物病原真菌的作用，且不 易產生耐藥性。同時，吩嗪環(huán)上的不同取代基使得各種吩嗪類化合物呈現(xiàn)不同顏色，在穩(wěn)定 性和抗菌譜上也存在一定的差異，可以作為不同的農業(yè)殺菌劑使用。天然的吩嗪類化合物 有包括吩嗪-1-甲酰胺、吩嗪-1-羧酸和2-羥基吩嗪等五十多種，在防治植物真菌性病害 方面起著重要的作用，具有廣泛的應用價值。其中，吩嗪-1-羧酸的結構式如下：
[0004]
[0005] 假單胞菌，作為一類廣泛分布于自然界中的革蘭氏陰性菌，是最早發(fā)現(xiàn)產吩嗪化 合物的菌屬。其中研究最多的是人類條件致病菌銅綠假單胞菌（P.aeruginosa)，其他還包 括兩個亞型的惡臭假單胞菌（P.putida)，四個亞型的焚光假單胞菌（P.fluorescens)，綠 針假單胞菌（P.chlororaphis)等。
[0006] 有研究人員率先利用銅綠假單胞菌株M18開發(fā)出了具有廣譜、高效、安全和能 有效控制真菌性根腐和莖腐的生物農藥--吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，簡稱PCA，CAS號為 2538-68-3)(專利號為CN1369566、CN200610023459. 9、CN200910198664. 2)，定名為"申嗪霉素"，主要用于防治水稻紋枯病、小麥赤霉病、黃瓜和 西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等，并獲得了農業(yè)部頒發(fā)的新農藥藥證（農藥登 記號TO20110314和TO20110315)。在許多地區(qū)進行的防治西瓜枯萎病的田間藥效實驗 結果表明，通過苗期的灌根和發(fā)病初期葉面的噴霧，申嗪霉素對西瓜枯萎病的防治達到 75%-80%。在大田推廣是應用試驗，申嗪霉素防治效果明顯優(yōu)于國內外同類產品，可有效 替代國外進口產品。目前在上海、江蘇、江西和湖南等地推廣應用達500萬畝次以上，避免 經濟損失5億元。申嗪霉素因其具有廣譜抑制各種農作物病院真菌，較其他藥劑高效、促進 農作物高產、與環(huán)境相容性好等優(yōu)點，已經成為一種廣譜高效防止農作物病害的新型生物 農藥，被農業(yè)部全國農業(yè)技術推廣中心列為2011~2015年全國重點農藥推廣品種。2013 年，何亞文分離到一株銅綠假單胞菌PA120,可以同時合成兩種吩嗪衍生物一一吩嗪-1-羧 酸和吩嘆-1-甲醜胺（phenazine-l-carboxamide,CAS號為 550-89-0,簡稱PCN)(專利號 CN201310511796. 2)〇
[0007] 此外，吩嗪-1-羧酸的合成還可以采用化學方法。2013年，李雨等報道了一種 如下所示的申嗪霉素合成方法，反應條件條件苛刻，原料價格價格相對昂貴，反應后處理 繁瑣（專利號CN103373967)。2014年，朱紅軍等以1-甲基吩嗪為原料，通過三步合成 了吩嗪-1-羧酸，反應副產物多，原料轉化率不高，分離純化困難且存在環(huán)境污染的問題 (CN104045601A)。目前均未見到相關專利轉化或者產業(yè)化的報道。
[0008] 因此，吩嗪-1-羧酸的工業(yè)化生產方法仍然是微生物合成，比如上海農樂公司的 申嗪霉素系列產品。但是，目前生物合成吩嗪-1-羧酸的專利菌株均為銅綠假單胞菌，該菌 屬于人類的條件致病菌；此外，在這類細菌中，吩嗪-1-羧酸僅是一系列吩嗪衍生物的中間 產物，因此其代謝產物多，代謝調控復雜，阻礙了其菌種改造及吩嗪-1-羧酸產量的進一步 提升。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明目的在于克服上述技術中利用銅綠假單胞菌生產吩嗪-1-羧酸過程中 菌種致病性、代謝產物復雜、菌種改造困難等問題，提供一種利用綠針假單胞菌生產吩 嗪-1-羧酸的方法。
[0010] 本發(fā)明以綠針假單胞菌HT66為出發(fā)菌株，通過基因工程技術將HT66菌株中吩 嗪-1-羧酸的修飾基因PhzH敲除，構建HT66AphzH基因工程菌株，使得其次級代謝產物從 吩嗪-1-甲酰胺轉變成吩嗪-1-羧酸，可以用于生產申嗪霉素。
[0011] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：
[0012] 第一方面，本發(fā)明提供一種用于生產吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株，由敲除綠針 假單胞菌HT66(PseudomonaschlororaphisHT66)CCTCCN0:M2013467 基因組中的phzH基 因得到。
[0013] 作為優(yōu)選方案，所述phzH基因的堿基序列如SEQIDNO. 1所示。
[0014] 作為優(yōu)選方案，所述phzH基因的對應蛋白質的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0015] 作為優(yōu)選方案，敲除所述phzH基因的方法包括插入突變法和無痕法。
[0016] 作為優(yōu)選方案，所述插入突變法敲除phzH基因包括如下步驟：
[0017] A、擴增PhzH基因片段，并插入pE)Q8TC質粒中；
[0018] B、擴增卡那霉素或慶大霉素等抗性基因，插入phzH基因中間，使phzH基因發(fā)生插 入突變；
[0019] C、將突變后的phzH基因與HT66基因組中的phzH基因發(fā)生同源重組，根據(jù)抗性篩 選出陽性克隆，即可。
[0020] 作為優(yōu)選方案，所述無痕法敲除phzH基因包括如下步驟：
[0021]i、擴增PhzH基因片段的上下游同源臂；
[0022] ii、融合PCR法連接上下游同源臂并插入pK18mobsacB質粒中（該質粒為假單胞 菌和大腸桿菌的穿梭質粒）；
[0023] iii、使重組質粒上的phzH基因的上下游同源臂片段與HT66基因組中的phzH基 因發(fā)生同源重組，篩選陽性克隆，即可。
[0024] 第二方面，本發(fā)明提供一種用于制備上述的基因工程菌株的培養(yǎng)基，由按質量分 數(shù)計的如下原料組成：
[0025] 胰蛋白胨或大豆蛋白胨2. 0~4. 5 %、甘油1. 9~3. 8 %、硫酸鎂.0. 02~0. 1 %、. 磷酸二氫鉀〇. 01~〇. 1 %、余量為水，PH6. 8~7. 5
[0026] 該培養(yǎng)基還可以用于利用本發(fā)明的基因工程菌株發(fā)酵制備吩嗪-1-羧酸。
[0027] 第三方面，本發(fā)明提供了所述的基因工程菌株在防治真菌性病害的微生物農藥中 的用途。
[0028] 作為有選方案，所述微生物農藥以吩嗪-1-羧酸為活性成分。
[0029] 第四方面，本發(fā)明提供了 一種利用本發(fā)明所述的基因工程菌株發(fā)酵制備吩 嗪-1-羧酸的方法，包括如下步驟：
[0030] 將基因工程菌株在培養(yǎng)基中，于20~40 °C下發(fā)酵20~50h后，將培養(yǎng)基的pH調 節(jié)至4以下，用有機溶劑進行萃取，純化，得到吩嗪-1-羧酸。
[0031] 本發(fā)明利用一株不同類型的綠針假單胞菌HT66(Pseudomonaschlororaphis HT66)CCTCCN0:M2013467出發(fā)，敲除其phzH基因后，該菌只能合成吩嗪-1-羧酸，而不能將 其進一步轉化為吩嗪-1-甲酰胺。該菌屬于植物根際促生細菌，無任何致病性報道；其發(fā)酵 水平高，野生株中吩嗪衍生物的量為420mg/L，大大高于其它的綠針假單胞菌或者銅綠假單 胞菌中的吩嗪合成水平；而且其原料簡單易得，發(fā)酵周期短，24h就產生大量吩嗪-1-羧酸， 36h可達到最高吩嗪產量；副產物少，不僅易于進行代謝工程改造，而且經過有機溶劑抽提 后，產物純度達到95%以上。因此它是吩嗪類化合物生產的理想菌種，適合大規(guī)模的開發(fā)和 應用。
[0032] 與現(xiàn)有的技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0033] 1、用于生產吩嗪-1-羧酸的菌株為綠針假單胞菌，至今未有致病性的報道，因此 其環(huán)境友好，安全可靠；
[0034] 2、綠針假單胞菌的代謝產物種類少，代謝調控機制相對簡單，易于進行代謝工程 改造；
[0035] 3、本方法生產成本低：本菌株營養(yǎng)要求簡單，原料便宜易得，且發(fā)酵液中副產物 少，易于分離提取，生產工藝簡單易行。
【附圖說明】
[0036] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點將會變得更明顯：
[0037] 圖1為綠針假單胞菌HT66和phzH敲除突變株中以PCR法分別擴增phzH基因及 其上下游片段的電泳圖。其中，從左到右依次為marker，HT66,HT66AphzH;
[0038] 圖2為綠針假單胞菌誘變高產P3株和phzH敲除突變株P3AphzH發(fā)酵液的對比。 其中，左邊為P3AphzH株，右邊為P3株；
[0039] 圖3為誘變高產株P3發(fā)酵液抽提物的HPLC檢測圖；
[0040] 圖4為基因工程菌株P3AphzH發(fā)酵液抽提物的HPLC檢測圖；
[0041] 圖5為誘變高產株P3株的生長曲線及吩嗪產物曲線示意圖；
[0042] 圖6為基因工程菌株P3AphzH的生長曲線及吩嗪產物示意圖。
【具體實施方式】
[0043] 下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域 的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普 通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干調整和改進。這些都屬于 本發(fā)明的保護范圍。
[0044]本發(fā)明的綠針假單胞菌HT66(PseudomonascholoraphisHT66)，該菌株已在中國 典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC)保藏，保藏單位地址為：中國.武漢.武漢大學，郵編 為：430072,保藏日期為：2013年10月12日，保藏編號為：CCTCCNO:M2013467。
[0045] 實施盤IphzH基因體外突變體的構建-插入突變
[0046] 以pBS(kan)質粒為模板，PCR擴增得到卡那抗性基因kan。根據(jù)綠針假單胞菌HT66 基因組中的PhzH基因序列設計引物，
[0047]