一種促進(jìn)重組極端耐熱α-淀粉酶可溶性表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種促進(jìn)重組極端耐熱a-淀 粉酶可溶性表達(dá)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] a-淀粉酶又稱為淀粉1，4_糊精酶，是一種內(nèi)切酶，能隨機(jī)地切斷淀粉、糖原、寡 聚或多聚糖分子內(nèi)的a-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用 最為廣泛的酶制劑之一。目前，a-淀粉酶已廣泛應(yīng)用于變性淀粉及淀粉糖、焙烤工業(yè)、啤 酒釀造、酒精工業(yè)、發(fā)酵以及紡織等許多行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)，是一種重要工業(yè)用酶。
[0003] 耐高溫a-淀粉酶是工業(yè)上最常用的酶制劑之一。工業(yè)上現(xiàn)今常用的耐熱a-淀 粉酶來(lái)源于Bacillus licheniformis (BLA)，其最適作用溫度為90°C而且需要與Ca2+作用 來(lái)維持其熱穩(wěn)定性。但該酶仍存在不足之處：首先，BLA的熱穩(wěn)定性仍不夠高；其次，BLA的 最適pH偏高為7. 0-8. 0 ;再次，BLA需要鈣離子來(lái)維持其熱穩(wěn)定性。
[0004] 重組極端耐熱a-淀粉酶PFA來(lái)源于極端嗜熱古菌P.furiosus，具有十分優(yōu)秀的 酶學(xué)性質(zhì)與酶學(xué)特點(diǎn)，在多項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)方面遠(yuǎn)優(yōu)于目前市場(chǎng)上的傳統(tǒng)的耐熱a-淀粉酶。 例如其最適溫度接近1〇〇°C，并具有極其優(yōu)良的耐熱性，在100°C數(shù)小時(shí)不喪失活性（一般 耐熱淀粉酶如BLA在接近100°C時(shí)的半衰期僅有數(shù)分鐘）。同時(shí)，極端耐熱a-淀粉酶PFA 的活性與耐熱性均不需要另外添加鈣離子，且其最適PH為酸性，可以大大便利工業(yè)應(yīng)用過(guò) 程中的后續(xù)環(huán)節(jié)。另外，該酶的淀粉水解產(chǎn)物主要成分為麥芽寡糖，以G2-G7為主，單糖（葡 萄糖）含量低于2%。這些優(yōu)點(diǎn)與特點(diǎn)提示重組PFA有望在包括淀粉高溫液化、超高純度高 麥芽糖漿的生產(chǎn)以及紡織印染等等多種工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)揮卓越的作用，具有極高的潛 在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
[0005]P.furiosus是從海底火山溫泉中的分離得到的絕對(duì)厭氧菌，最適生長(zhǎng)溫度 10CTC[HaruyukiAtomi等，CurrentOpinioninBiotechnology，2011，5(22) :618_626]， 培養(yǎng)相對(duì)較為復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)培養(yǎng)，PFA的較大量制備只能通過(guò)外源重組表達(dá)方 能夠?qū)崿F(xiàn)。迄今已有多家國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室對(duì)PFA的蛋白結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)以及重組表達(dá)等方面 進(jìn)行了研究，至今尚未有適合該酶大規(guī)模制備方法的報(bào)道。國(guó)外的研究結(jié)果與本發(fā)明人對(duì) PFA的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)重組PFA在E.coli中大量表達(dá)時(shí)，表達(dá)的重組PFA主要是不溶性的 包涵體，這為該酶的大規(guī)模純化與制備等下游工程帶來(lái)了極大的不便。
[0006] 本發(fā)明人前期對(duì)重組極端耐熱alpha-淀粉酶PFA進(jìn)行了較為深入的研究。首 先研究了重組PFA在大腸桿菌中進(jìn)行大量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組PFA主要以不溶性的包涵體形 式表達(dá)。之后對(duì)PFA包涵體純化復(fù)性的方法進(jìn)行了研究，建立了堿變性-加熱-稀釋復(fù) 性的純化方法，獲得了具有較高生物活性的重組PFA[LisaWang等，JIndMicrobiol Biotechnol. 2007. (34) : 187 - 192 ;張毅等，中國(guó)發(fā)明專利：一種嗜熱a-淀粉酶的制備純 化方法，專利號(hào)：ZL20061 0025974.0]。在進(jìn)一步對(duì)純化酶的穩(wěn)定性研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，一定 濃度的去垢劑對(duì)重組PFA的酶活性沒(méi)有影響，由此建立了采用去垢劑對(duì)重組PFA包涵體進(jìn) 行溶解復(fù)性與純化的方法[張毅等，中國(guó)發(fā)明專利：重組極端耐熱a-淀粉酶的復(fù)性與純化 方法，專利號(hào)：ZL200810039429. 6]。
[0007] 盡管如此，對(duì)于重組酶而言，可溶性表達(dá)更具應(yīng)用與生產(chǎn)的便利性及生產(chǎn)成本的 可控性。由于重組極端耐熱alpha-淀粉酶PFA自身的特性，現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)該酶實(shí)現(xiàn)可溶 性的重組高表達(dá)十分困難。
[0008] 因此，本領(lǐng)域還需要進(jìn)一步研究適用于重組表達(dá)極端耐熱alpha-淀粉酶PFA的表 達(dá)系統(tǒng)以及表達(dá)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)重組極端耐熱a_淀粉酶可溶性表達(dá)的方法。
[0010] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組表達(dá)極端耐熱a-淀粉酶的方法，所述方法 包括：將極端耐熱a-淀粉酶的編碼基因與分子伴侶蛋白Prefoldin的編碼基因共同表達(dá)， 獲得可溶性的極端耐熱a-淀粉酶。
[0011] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的共同表達(dá)的表達(dá)宿主包括：原核細(xì)胞，真核細(xì)胞。較佳地， 所述的原核細(xì)胞包括但不限于大腸桿菌細(xì)胞；所述的真核細(xì)胞包括但不限于酵母細(xì)胞。優(yōu) 選地，所述的表達(dá)宿主是大腸桿菌細(xì)胞。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的分子伴侶蛋白Prefoldin來(lái)源于極端嗜熱古菌 P.furiosus〇
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的極端耐熱a_淀粉酶來(lái)源于極端嗜熱古菌P.furiosus。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的極端耐熱a-淀粉酶的編碼基因與分子伴侶蛋白 Prefoldin的編碼基因在大腸桿菌細(xì)胞中共同表達(dá)。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的共同表達(dá)的方法包括：
[0016](1)提供表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有極端耐熱a-淀粉酶的表達(dá)盒和分子伴 侶蛋白Prefoldin的表達(dá)盒；
[0017] (2)將（1)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有所述表達(dá)載體的重組大腸 桿菌細(xì)胞，獲得可溶性的極端耐熱a-淀粉酶。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的含有極端耐熱a-淀粉酶的表達(dá)盒和分子伴侶蛋白 Prefoldin的表達(dá)盒分別位于不同的表達(dá)載體中，或位于同一表達(dá)載體中。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體包括（但不限于）：pT7473,pACYC或p⑶F。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的極端耐熱a-淀粉酶是極端耐熱a-淀粉酶PFA。
[0021] 在本發(fā)明的另一方面，提供分子伴侶蛋白Prefoldin的用途，用于促進(jìn)重組極端 耐熱a-淀粉酶可溶性表達(dá)。
[0022] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的分子伴侶蛋白Prefoldin通過(guò)與極端耐熱a-淀粉酶共 同表達(dá)，促進(jìn)極端耐熱a-淀粉酶的可溶性表達(dá)。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，提供重組的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞中含有極端耐熱 a-淀粉酶的表達(dá)盒和分子伴侶蛋白Prefoldin的表達(dá)盒。
[0024] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
[0025] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組表達(dá)極端耐熱a-淀粉酶的試劑盒，所述試 劑盒中包括：
[0026] 表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有極端耐熱a_淀粉酶的表達(dá)盒和分子伴侶蛋白 Prefoldin的表達(dá)盒。
[0027] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的含有極端耐熱a-淀粉酶的表達(dá)盒和分子伴侶蛋白 Prefoldin的表達(dá)盒分別位于不同的表達(dá)載體中，或位于同一表達(dá)載體中。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體包括（但不限于）：pT7473,pACYC或p⑶F。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：大腸桿菌細(xì)胞。
[0030] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1、來(lái)源于P.furiosus的分子伴侶蛋白Prefoldin和Hsp60對(duì)重組極端耐熱淀 粉酶PFA可溶性表達(dá)的影響。
[0032] A為各菌株破碎后離心上清液中PFA的比活，BL21 (DE3)為空宿主菌，PFA 為重組PFA表達(dá)菌，PFA+pACYC為同時(shí)轉(zhuǎn)化pACYC質(zhì)粒與PFA表達(dá)質(zhì)粒的菌株， PFA+pACYC-Prefoldin為同時(shí)轉(zhuǎn)化pACYC-Prefoldin質(zhì)粒與PFA表達(dá)質(zhì)粒的菌株， PFA+pACYC-Hsp60為同時(shí)轉(zhuǎn)化pACYC-Hsp60質(zhì)粒與PFA表達(dá)質(zhì)粒的菌株。
[0033]B為各菌株破碎后的離心上清與沉淀樣品的SDS-PAGE電泳圖，各泳道中樣品 如下：M為marker;1-2為BL21(DE3)菌體破碎后上清與沉淀，3-4為重組PFA表達(dá)菌體 破碎上清與沉淀，5-6為同時(shí)轉(zhuǎn)化pACYC質(zhì)粒與PFA表達(dá)質(zhì)粒的菌體破碎上清與沉淀 (PFA+pACYC)，7-8為同時(shí)轉(zhuǎn)化pACYC-Prefoldin質(zhì)粒與PFA表達(dá)質(zhì)粒的菌體破碎上清與沉 淀（PFA+pACYC-Prefo