；其中，發(fā)酵液用比色法測定P_葡萄糖苷酶酶活，菌絲經(jīng)無菌水多次洗滌后，進(jìn) 行葡萄糖苷酶的提取。
[0040] 2、分離的菌絲體按照以下方法進(jìn)行粗酶液的提取
[0041] (1)打漿處理
[0042] 向步驟1提取出的菌絲體中加入蒸餾水，在冰?。?10~KTC)中進(jìn)行打漿處理 (打漿時的轉(zhuǎn)速為22000r/min)，每打漿Imin間歇lmin，打漿次數(shù)設(shè)置為1次、3次、5次、7 次，得到粗酶液。
[0043] (2)反復(fù)凍融
[0044] 該方法不進(jìn)行菌絲體與發(fā)酵液的分離，將發(fā)酵后的菌液分別置于_20°C、-40°C 和-80°C下冷凍8h，然后常溫解凍lh，反復(fù)三次，得粗酶液。
[0045] (3)超聲破碎
[0046] 向步驟1提取出的菌絲體中加入蒸餾水，在冰浴HO~KTC )中進(jìn)行超聲破碎， 超聲功率200W，每超聲Imin間歇lmin，超聲次數(shù)為1次、5次、10次、15次、20次，得粗酶液。
[0047] (4)升溫自溶
[0048] 該方法也不進(jìn)行菌絲體與發(fā)酵液的分離，當(dāng)菌種發(fā)酵至第6天時，將培養(yǎng)溫度分 別調(diào)到28°C、34°C、40°C、46°C，到第8天發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液即為粗酶液。
[0049](5)打漿處理+超聲破碎
[0050] 向步驟1提取出的菌絲體中加入蒸餾水，在冰?。?10~10°C)中進(jìn)行打漿處理 (打漿時的轉(zhuǎn)速為22000r/min)，打漿Imin后，在冰?。?10~KTC)中進(jìn)行超聲破碎，超聲 功率200W，每超聲Imin間歇lmin，超聲次數(shù)為5次、8次、10次，得粗酶液。
[0051] (6)打漿處理+反復(fù)凍融
[0052] 向步驟1提取出的菌絲體中加入蒸餾水，在冰浴（-10~10°C)中進(jìn)行打漿處理 (打漿時的轉(zhuǎn)速為22000r/min)，打漿Imin后，置于-40°C下冷凍8h，然后常溫解凍lh，反復(fù) 三次，得粗酶液。
[0053] (7)打漿處理+超聲破碎+反復(fù)凍融
[0054] 向步驟1提取出的菌絲體中加入蒸餾水，在冰?。?10~10°C)中進(jìn)行打漿處理 (打漿時的轉(zhuǎn)速為22000r/min)，打漿Imin后，在冰?。?10~10°C)中進(jìn)行超聲破碎，超 聲功率200W，每超聲Imin間歇lmin，超聲次數(shù)為5次，置于-40°C下冷凍8h，然后常溫解凍 lh，反復(fù)三次，得粗酶液。
[0055] (8)反復(fù)凍融+打漿處理+超聲破碎
[0056]該方法不進(jìn)行菌絲體與發(fā)酵液的分離，將發(fā)酵后的菌液置于_40°C冷凍8h，然后 常溫解凍lh，反復(fù)三次，然后在冰?。?10~KTC)中進(jìn)行打漿處理（打漿時的轉(zhuǎn)速為 22000r/min)，打漿Imin后，在冰浴（-10~KTC)中進(jìn)行超聲破碎，超聲功率200W，每超聲 Imin間歇lmin，超聲次數(shù)為5次，得粗酶液。
[0057] 3、采用上文所述的酶活測定方法測定上述不同提取方法所得粗酶液的酶活，具體 如表1所示；
[0058] 表1菌絲體采用不同提取方法所測得的總酶活的結(jié)果對比
[0059]
[0060] 從表1可知，采用方法（5) "打漿處理+超聲破碎"的效果最佳；并且先打漿處理 lmin，再超聲破碎IOmin時，測得的酶活最高，為3. 22U/mL，比不經(jīng)任何提取處理的酶活高 2. 19倍；此外，當(dāng)先打衆(zhòng)處理lmin，再超聲破碎5min時，酶活就已經(jīng)達(dá)到3. 12U/mL，這與單 一的超聲破碎處理相比節(jié)省了一半的超聲時間。
[0061] 實施例2
[0062] 本實施例采用灰樹花作為菌種，該菌種來源于本實驗室保存菌種。
[0063] 1、菌絲體與發(fā)酵液的分離
[0064] 將灰樹花按照上述菌種培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵8天后，進(jìn)行抽濾，分離菌絲 體和發(fā)酵液；其中，發(fā)酵液用比色法測定0 -葡萄糖苷酶酶活，菌絲經(jīng)無菌水多次洗滌后， 進(jìn)行(6-葡萄糖苷酶的提取。
[0065] 2、分離的菌絲體按照以下方法進(jìn)行粗酶液的提取
[0066] 向步驟1提取出的菌絲體中加入蒸餾水，在冰?。?10~10°C)中進(jìn)行打漿處理 (打漿時的轉(zhuǎn)速為22000r/min)，打漿Imin后，在冰浴（-10~KTC)中進(jìn)行超聲破碎，超聲 功率200W，每超聲Imin間歇lmin，超聲次數(shù)為5次，得粗酶液。
[0067] 3、采用上文所述的酶活測定方法測定上述提取方法所得粗酶液的酶活，測得灰樹 花總酶活為I. 87U/mL。不經(jīng)提取處理的灰樹花酶活為0. 96U/mL，通過先打漿處理lmin，再 超聲破碎5min使酶活提高了 1. 95倍。
【主權(quán)項】
1. 一種真菌菌絲體液體深層發(fā)酵中產(chǎn)生的胞內(nèi)酶的提取方法，其特征在于，包括：取 發(fā)酵液，分離得到菌絲體，菌絲體用水稀釋后，依次進(jìn)行打漿處理、超聲破碎處理，得到粗酶 液。2. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述打漿處理的溫度為-10~KTC，時 間為 0? 5 ~1.0 min。3. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述打漿處理的轉(zhuǎn)速為20000~ 21000r/min〇4. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，打漿處理過程中，打漿0. 5~1.0 min后 間歇1~2min。5. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述超聲破碎處理的超聲功率為180~ 22016. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述超聲破碎處理的溫度為-10~ 10°C，時間為5~IOmin。7. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，超聲破碎處理過程中，每超聲破碎1~ 2min間歇1~2min，超聲的次數(shù)為5次。8. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的真菌為靈芝、香菇或灰樹花。9. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的胞內(nèi)酶為P -葡萄糖苷酶。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種真菌菌絲體液體深層發(fā)酵中產(chǎn)生的胞內(nèi)酶的提取方法，該方法包括：取發(fā)酵液，分離得到菌絲體，菌絲體用水稀釋后，依次進(jìn)行打漿處理、超聲破碎處理，得到粗酶液。本發(fā)明采用打漿處理和超聲破碎處理結(jié)合的方法，獲取真菌菌絲體液體深層發(fā)酵中產(chǎn)生的胞內(nèi)酶的粗酶液，酶活損失少。本發(fā)明方法操作簡單，方便可行，適用于多種真菌菌絲體液體深層發(fā)酵產(chǎn)酶的提取，如靈芝、香菇、灰樹花等。
【IPC分類】C12N9/42, C12R1/645
【公開號】CN105087522
【申請?zhí)枴緾N201510551968
【發(fā)明人】何國慶, 秦可欣, 劉同杰, 石彥國, 徐莉莎
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月1日