Flammeovirga sp. SJP92 β-瓊膠酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及瓊膠酶，尤其是涉及Flammeovirga sp. SJP92 P -瓊膠酶及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 瓊膠由瓊脂糖（agarose)和瓊脂膠（agaropeetin)組成。瓊脂糖是由 1，3-0-0 -D-半乳吡喃糖和1，4-0-3, 6-內(nèi)醚-a-L-半乳吡喃糖反復(fù)交替組成的鏈狀分子； 瓊脂膠結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，在交聯(lián)的半乳糖鏈上含有D-半乳糖、3, 6-半乳糖苷、半乳糖醛酸和 硫酸基、丙酮酸等取代基團。
[0003] 根據(jù)瓊膠酶水解瓊脂糖方式不同，可將其分為a_瓊膠酶和P_瓊膠酶。a_瓊 膠酶裂解瓊脂糖的a-1，3糖苷鍵，生成以P-D-半乳糖為非還原性末端和以3, 6-內(nèi) 醚-<1-1^-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖（3831'〇〇118〇83〇〇1^1^(168)系列。而0-瓊膠 酶則裂解瓊脂糖的(6-1, 4-糖苷鍵，生成以P-D-半乳糖為還原性末端和以3, 6-內(nèi) 醚-〇-1^-半乳糖為非還原性末端的的新瓊寡糖（11603831'0〇118〇83〇〇1^1^(168)系列。目前 所發(fā)現(xiàn)的瓊膠酶中，大多數(shù)都是(6-瓊膠酶，只有少數(shù)幾種是a-瓊膠酶。
[0004] 瓊膠酶在科學(xué)研究、食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。在分子生物學(xué) 實驗中，利用瓊膠酶從瓊脂糖凝膠中回收DNA和RNA，已經(jīng)被證明是最好的方法之一。由于 瓊膠是某些紅藻細胞壁的重要組成成分，因此瓊膠酶可以用作海藻酶解的工具酶，來獲得 DNA、蛋白質(zhì)、單細胞或原生質(zhì)體，用于海藻細胞生理生化的研究，以及用于進行細胞間的融 合和目的基因的導(dǎo)入。通過測定瓊膠酶水解某些海藻多糖的水解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)可用于推測海藻 多糖的結(jié)構(gòu)。由于酶降解具有專一性、高效性、降解條件和過程易于控制、無副反應(yīng)等優(yōu)點， 因此該方法應(yīng)用較廣泛。酶能夠降解多糖，得到相對分子質(zhì)量比較均一的降解物，對多糖的 主體結(jié)構(gòu)不會產(chǎn)生影響，因此還可利用瓊膠酶水解藻類獲得海藻單細胞作為飼料用于海水 動物的養(yǎng)殖。此外，瓊膠酶還可用于瓊脂寡糖的制備。瓊脂寡糖在食品生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng) 用，如作為天然防腐劑、淀粉老化抑制劑、高甜度甜味劑的填充劑及分散劑、功能性食品基 料、抗氧化劑等。在藥物應(yīng)用方面，瓊脂等海藻多糖一定分子量的降解產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗 病毒和增強免疫等作用。近來在日用化工領(lǐng)域又發(fā)現(xiàn)了瓊脂寡糖的一些新用途，日本以瓊 脂寡糖為添加劑生產(chǎn)的化妝品對皮膚的保濕效果良好，對頭發(fā)也有很好的調(diào)理作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的是提供Flammeovirga sp. SJP92 P-瓊膠酶；
[0006] 本發(fā)明的第二目的是提供Flammeovirga sp. SJP92 P-瓊膠酶基因agaB的核苷酸 序列；
[0007] 本發(fā)明的第三目的是提供Flammeovirga sp. SJP92 P-瓊膠酶蛋白的氨基酸序 列；
[0008] 本發(fā)明的第四目的是提供Flammeovirga sp. SJP92 P-瓊膠酶的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的第五目的是提供Flammeovirga sp. SJP92 P -瓊膠酶AgaB的生物學(xué)活 性。
[0010] 所述Flammeovirgasp. SJP920 -瓊膠酶已于2014年11月27日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué) 院微生物研究所，郵編：1〇〇1〇1，保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo. 10071。
[0011] 所述 Flammeovirgasp. SJP92 0 -瓊膠酶基因，其編碼 Flammeovirga sp. SJP92P-瓊膠酶的核苷酸序列，記作agaB。
[0012] 所述Flammeovirgasp. SJP92P-瓊膠酶基因agaB的分子類型為DNA，序列 特征：長度為2547bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結(jié)構(gòu)為線性，所述Flammeovirga sp. SJP92 -瓊膠酶基因agaB的序列如下所示，記為SEQIDNo. 1 :

[0015] 本發(fā)明所述Flammeovirgasp.SJP92P-瓊膠酶基因，其核苷酸序列采用以下方法 獲得：提取 Flammeovirgasp.SJP92 的總 DNA，以合成序列SEQID No. 3,SEQID No. 4 作為 引物，經(jīng)PCR擴增獲得agaB基因核苷酸序列SEQID No. 1。agaB基因相關(guān)的核苷酸序列 SEQID No. 1通過基因預(yù)測獲得基因編碼的多肽SEQID No. 2序列。然后通過原核重組表 達agaB基因，純化agaB基因的表達產(chǎn)物，并通過生物學(xué)方法證明agaB基因編碼的多肽SEQ IDNo. 2 (不含信號肽）具有瓊膠酶活性。
[0016] 本發(fā)明所述Flammeovirgasp.SJP92P-瓊膠酶包括具有降解瓊脂糖活性的 Flammeovirgasp.SJP92 0 -瓊膠酶 AgaB。
[0017] 所述合成序列SEQIDNo. 3：CGGGATCCCAGGATTGGAGCGGTATT〇
[0018] 所述合成序列SEQIDNo. 4：CCGCTCGAGTTAGTTCATTAGTACCACTTT〇
[0019] 所述Flammeovirgasp.SJP92P-瓊膠酶AgaB的分子類型為蛋白質(zhì)，序列特征：長 度為849aa，類型為氨基酸，所述Flammeovirgasp.SJP92 0 -瓊膠酶AgaB的序列如下所示， 記為SEQIDNo. 2 :
[0021] 所述Flammeovirgasp.SJP92 0 -瓊膠酶，其蛋白具有SEQIDNo. 2所示氨基酸序 列的多肽；或?qū)EQIDNo. 2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而 形成的，且具有與SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列相似功能的多肽。
[0022] 本發(fā)明所述Flammeovirgasp.SJP92P-瓊膠酶的制備方法，包括以下步驟：
[0023] I) Flammeovirgasp.SJP92 總DNA的提??；
[0024] 2) Flammeovirgasp.SJP92 0 -瓊膠酶 agaB 的PCR擴增和序列分析；
[0025] 3)Flammeovirgasp.SJP92P-瓊膠酶的重組表達以及純化。
[0026] 本發(fā)明通過提取Flammeovirgasp.SJP92的總DNA，通過引物擴增，克隆和鑒定了 0 _瓊膠酶基因agaB。通過構(gòu)建重組原核表達載體，在大腸桿菌中進行重組蛋白表達，克服 了原菌分離純化過程中復(fù)雜繁瑣、產(chǎn)量低等不足。同時純化后的蛋白純度高、活力好，為該 蛋白能廣泛應(yīng)用于生物、食品、醫(yī)藥等研究領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0027] 圖1為agaB基因重組表達的SDS-PAGE電泳圖譜。M:蛋白Marker;1 :重組載 體pET-28sumo_agaB在菌株BL21 (DE3)的未誘導(dǎo)表達；2 :重組載體pET-28sumo_agaB在 菌株BL21(DE3)的誘導(dǎo)表達后超聲破碎后上清；3 :重組載體pET-28sum〇-agaB在菌株 BL21(DE3)的誘導(dǎo)表達超聲破碎后包涵體。
[0028] 圖2為AgaB-sumo純化的SDS-PAGE電泳圖譜。M:蛋白Marker;1 :經(jīng)鎳柱介質(zhì)純 化所得的目的蛋白AgaB-sumo。
[0029] 圖3為AgaB酶活染色圖譜。M:蛋白Marker;1 :AgaB對應(yīng)的SDS-PAGE圖；2:AgaB 酶活染色.（此結(jié)果中的目的蛋白已切除sumotag，其分子量為15kDa)。
[0030] 圖4為TLC檢測重組-瓊膠酶AgaB的降解產(chǎn)物。1 :重組-瓊膠酶AgaB的降 解產(chǎn)物；2 :新瓊八糖；3 :新瓊四、六糖。
[0031] 圖5為溫度對重組P-瓊膠酶AgaB的影響圖譜以及該酶的溫度穩(wěn)定性。橫坐標 表示不同溫度；縱坐標表示瓊膠酶的相對活性。
[0032] 圖6為pH對重組-瓊膠酶AgaB的影響圖譜以及該酶的PH穩(wěn)定性。橫坐標表 示不同pH;縱坐標表示瓊膠酶的相對活性。
【具體實施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如分子克隆實驗室手冊（1、薩姆布魯克，拉塞爾（著），黃培堂（譯），《分子克隆實驗指 南》，科學(xué)出版社，2002年，第三版）中所述的實驗條件，或按照試劑或儀器生產(chǎn)廠商所建議 的條件。
[0034] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，其具體步驟是：
[0035] I.Flammeovirgasp.SJP92總DNA的提?。ū緦嶒灢捎蒙虾Ｙ惏偈⒐驹噭┖刑?取基因組，具體步驟和試劑請參照該公司試劑盒說明書）：
[0036] 取2mL離心管，倒入預(yù)先培養(yǎng)的菌液，13000rpm離心2min后棄上清；將菌體懸浮 于IOOyLTE緩沖液中，加入ImLXN結(jié)合液，輕柔顛倒混勻；將混合液小心轉(zhuǎn)入離心柱中， 靜置3~5min，然后13000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液；在離心柱中加入0. 5mL漂 洗液（加入漂洗液后靜置2~3min)，13000rpm離心30s，共漂洗4次；再用0. 5mL70%乙 醇漂洗1~2次，靜置2~3min后13000rpm離心30s;將離心純化柱再次離心Imin;將離 心純化柱套入一個新的干凈的I. 5mL離心管中，開蓋放置2~3min使乙醇揮發(fā)；之后加入 20yLddH20于硅膠膜上；靜置2~5min后，13000rpm離心lmin。收集的液體即為所提取 的基因組。
[0037] 2.Flammeovirgasp.SJP92 0 -瓊膠酶基因的PCR擴增和序列分析
[0038] 以Flammeovirgasp.SJP92總DNA為模板，用引物F和R擴增P-瓊膠酶agaB基 因（不含信號肽）。
[0039] F：CGGGATCCCAGGATTGGAGCGGTATT(SEQIDNo. 3)；
[0040] R：CCGCTCGAGTTAGTTCATTAGTACCACTTT(SEQ ID No. 4)；
[0041] 劃線部分GGATCC代表BamH