基因工程改造蛋白酶k及其生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種基因工程改造蛋白酶K及其生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，蛋白酶K的生產(chǎn)主要有兩條路徑，一是直接從真菌中直接提取，二是通過基 因重組后表達(dá)。國內(nèi)蛋白酶K產(chǎn)品主要依靠進(jìn)口和真菌中直接提取，直接提取所需周期較 長，以現(xiàn)有科技水平大概需要20天左右；而基因重組表達(dá)需要前期進(jìn)行大量的研發(fā)，如果 能夠表達(dá)成功則可以將生產(chǎn)周期縮短至3~4天。從長遠(yuǎn)發(fā)展和大規(guī)模生產(chǎn)的角度考慮， 優(yōu)選進(jìn)行基因重組后表達(dá)。因此，有必要采用基因重組技術(shù)并通過基因的合成與突變改造， 構(gòu)建了高效表達(dá)載體，通過高密度發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了重組蛋白酶K的工業(yè)化生產(chǎn)，進(jìn)而取代進(jìn)口 產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種基因工程改造的蛋白酶K，其酶活性為同種天然蛋白 酶活性2倍以上，能夠?qū)⑸a(chǎn)周期縮短至3~4天，極大的提高了生產(chǎn)效率。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案進(jìn)行實(shí)施：
[0005] 基因工程改造蛋白酶K，其特征在于：將如SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列在如下 位點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的突變：
[0006] N95C,P97S,S107D,S123A,I132V,E138A,M145F,Y151A,V167I,L180I,Y194S,A199S ，K208H,A236V,R237N,P265S,V267I,S273T,G293A,L299C,I310K,K332R,S337N和P355S。
[0007] 通過合成與擴(kuò)增獲得蛋白酶K基因，然后通過克隆，轉(zhuǎn)化，將蛋白酶K基因整合到 酵母染色體上，通過酵母的篩選，選出能夠高效表達(dá)目標(biāo)蛋白的優(yōu)質(zhì)菌株，利用高密度發(fā)酵 技術(shù)，進(jìn)行高密度發(fā)酵表達(dá)蛋白酶K，然后經(jīng)過蛋白質(zhì)的分離純化，獲得高純度高活性蛋白 酶K。
【附圖說明】
[0008] 圖1為目的基因檢測(cè)結(jié)果；
[0009] 圖2為檢測(cè)蛋白水平結(jié)果；
[0010] 圖3為酶活測(cè)定Sigma-Aldrich結(jié)果；
[0011] 圖4為酶純度測(cè)定（SDS-PAGE)結(jié)果；
[0012] 圖5為酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0013] 圖6為蛋白電泳比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0014]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0015] -、目的基因的獲取
[0016] 采用基因重組技術(shù)并通過基因的合成與突變改造，構(gòu)建了高效表達(dá)載體；
[0017] 氨基酸突變點(diǎn)包括：N95C，P97S,S107D,S123A,I132V，E138A，M145F,Y151A,V167I, L180I,Y194S,A199S,K208H,A236V,R237N,P265S,V267I,S273T,G293A,L299C,I310K,K332R ,S337NandP355S；
[0018] 其中：N95C中N為原始氨基酸，95為蛋白序列中該氨基酸位置，C為突變后的氨基 酸）；
[0019] 蛋白酶K氨基酸序列，亦即SEQIDNO. 1為：
[0021] 二、高效表達(dá)載體的構(gòu)建
[0022] 合成后利用SalI酶切后線性化連接到pPIC3載體上，通過電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母細(xì) 胞中，為了獲得高穩(wěn)定的外源蛋白表達(dá)菌株，巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體連同外源基因通過 同源重組整合至宿主染色體基因組座位上。利用PCR方法鑒定高拷貝的菌株，如附圖1所 示；
[0023]
[0024] 三、高效表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)
[0025] 巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白適宜的溫度為30°C，溫度達(dá)到32°C時(shí)所有的蛋白 表達(dá)都會(huì)停止。在酵母生長或高量表達(dá)時(shí)會(huì)釋放出大量的熱量，因此，整個(gè)發(fā)酵過程中進(jìn)行 溫度的調(diào)節(jié)，熱交換，加熱、冷卻裝置等都是必不可少的。將種子菌株在YH)液體培養(yǎng)基中， 1 %甲醇誘導(dǎo)4天，收集菌體檢測(cè)蛋白水平。
[0026] 四、活性檢測(cè)；
[0027] 使用Sigma-Aldrich方法進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果如表1及附圖2所示。
[0028] 表1酶活性測(cè)定結(jié)果
[0029]
[0030] 五、小規(guī)模的高密度發(fā)酵
[0031] 種子培養(yǎng)：接種_80°C保存甘油菌到40mLYro液體培養(yǎng)基中，30°C，280rpm震蕩培 養(yǎng)過夜后得一級(jí)種子。將一級(jí)種子按10 %分別接種到裝有200mLYro液體培養(yǎng)基的兩個(gè)IL 搖瓶中，30°C，220rpm振蕩培養(yǎng)20h后，得到二級(jí)種子。
[0032] 甘油分批培養(yǎng)階段擴(kuò)增菌體：將上述400mL二級(jí)種子按5 %加入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng) 基的5L發(fā)酵罐中，設(shè)定參數(shù)：攪拌轉(zhuǎn)速、通氣和溫度30°C，pH5. 0,開始發(fā)酵培養(yǎng)。通過調(diào)節(jié) 攪拌速度、通氣量、罐壓等措施使DO維持在20%~35%左右，當(dāng)DO陡然上升接近100%時(shí)， 說明培養(yǎng)基中甘油已經(jīng)消耗殆盡，開始轉(zhuǎn)入短時(shí)間甘油補(bǔ)料分批階段培養(yǎng)菌體（菌體濃度 達(dá)到 90 ~150g/L)。
[0033] 上述培養(yǎng)階段每2h取樣一次，測(cè)定發(fā)酵液中酵母菌體細(xì)胞光密度和菌體濕重。
[0034] 甘油補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段擴(kuò)增菌體：以12ml/h/L初始發(fā)酵液的速率流加50%甘油 到發(fā)酵罐中，維持4h，同時(shí)提高攪拌速度、通氣量、罐壓等措施使DO維持在20 %~35 %左 右。停止補(bǔ)加甘油后，觀察DO值上升至100%后，繼續(xù)維持"甘油饑餓"狀態(tài)lh，然后轉(zhuǎn)入 甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段，誘導(dǎo)過程中流加氨水維持PH恒定，同時(shí)氨水也用作氮源。（菌體濃度達(dá) 到 180 ~220g/L)。
[0035] 上述培養(yǎng)階段每2h取樣一次，測(cè)定發(fā)酵液中酵母菌體細(xì)胞光密度和菌體濕重。
[0036] 甲醇補(bǔ)料分批誘導(dǎo)表達(dá)階段："饑餓"期結(jié)束后甲醇流加速率先以lml/h/L維持低 速流加4h，以使工程菌適應(yīng)以甲醇為唯一碳源的環(huán)境，再以每半小時(shí)增加10%的流速增到 3ml/h/L至誘導(dǎo)結(jié)束，通過調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量、罐壓和甲醇流加速率等措施使DO值維持 在20%~35%左右（菌體濃度達(dá)到350~45(^/1)。
[0037] 開始誘導(dǎo)表達(dá)后，每4h取樣一次，測(cè)定發(fā)酵液中酵母菌體細(xì)胞光密度OD6。。和菌體 濕重，并留上清用于蛋白分析。
[0038] 所用培養(yǎng)基為：
[0039] 種子培養(yǎng)基：Yro液體培養(yǎng)基
[0040] 發(fā)酵培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基及4. 35ml/LPTM1微量元素溶液，初始發(fā)酵pH5. 0。
[0041] PTM1 微量元素溶液（g/L) :CuS04 ? 5H206. 0,KI0. 08,MnSO4 ?H203. 0， Na2MoO4 ? 2H200. 2,H3BO3O. 02,CoCl2O. 5,ZnCl220. 0,FeS047H2065. 0,BiotinO. 2,H2S045.Oml/ L，混勻過濾除菌，4°C避光保存。
[0042]甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基：甘油50%，4. 35ml/LPTM1微量元素溶液。
[0043]甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)基：甲醇100%，4. 35ml/LPTM1微量元素溶液。
[0044] 六、高密度發(fā)酵產(chǎn)品的檢測(cè)及產(chǎn)率活性分析
[0045]蛋白酶K純度比較實(shí)驗(yàn)（SDS-PAGE)，如圖3所示，結(jié)果：蛋白酶K純度超過99. 2% (掃描SDS-PAGE膠）；
[0046] 酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：(_20°C冷凍條件下，12個(gè)月的數(shù)據(jù)），如圖4所示，結(jié)果：干粉狀態(tài) 正確儲(chǔ)存，一年內(nèi)酶活保持不變；溶解狀態(tài)酶活一年內(nèi)降低小于2 %。
[0047] 七、發(fā)酵規(guī)模放大至中試規(guī)模；
[0048] 種子培養(yǎng)：一級(jí)種子培養(yǎng)：將50ml種子培養(yǎng)基裝入500ml的三角瓶中，用8層紗布 包扎瓶口，滅菌后將平板上的菌落接種于三角瓶內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，28°C培養(yǎng)36h。二 級(jí)種子培養(yǎng)：將500ml種子培養(yǎng)基裝入5L的三角瓶中，用8層紗布包扎瓶口，滅菌后將一 級(jí)種子液接種于三角瓶內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，28°C培養(yǎng)24h。
[0049] 發(fā)酵培養(yǎng)：50L發(fā)酵罐培養(yǎng)：在50L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基初始裝液量為330L，按照 8 %的接種量接入種子液，通氣量控制在40L/min，攪拌轉(zhuǎn)速500L/min。培養(yǎng)溫度28°C，罐 壓0. 04MPa，PH控制在5. 8。200L發(fā)酵罐培養(yǎng)：在200L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基初始裝液量為 120L，按照6 %的接種量接入種子液，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min將通氣量控制在160L/min。培養(yǎng) 溫度28°C，罐壓0. 04MPa，PH控制在5. 8。
[0050] 補(bǔ)料組成：50%甘油，1.2