一種制備尿激酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分離純化領(lǐng)域，特別涉及一種制備尿激酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]尿激酶是一種堿性蛋白酶，由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人體及哺乳動物的尿液中，血液凝固時人體的正常機能，但是某些病理狀態(tài)下，在血管內(nèi)形成血酸，堵塞血液流通時就會造成嚴重后果，尿激酶是溶血栓藥物，但它并不直接用于血塊本身，而是首先激活體內(nèi)的纖溶酶脘，成為有活性的纖溶酶，纖溶酶作用于纖維蛋白酶凝塊，使其分解成可溶性多碳。
[0003]尿激酶由多種分子量形式，高分子量的尿激酶溶解血栓臨床效果要比低分子量的約高一倍，因此，國際上把尿激酶的分子量作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢查項目之一。
[0004]尿激酶在凍干狀態(tài)下可穩(wěn)定數(shù)年，lmg/ml的無菌溶液可以在冰箱中保存數(shù)月，在鹽濃度低于0.03MNaCl時穩(wěn)定性下降，在極低的鹽濃度時，隨著酶的失活產(chǎn)生沉淀，人血蛋白或明膠可防止酶的表面變性作用。
[0005]由于尿激酶有著重要的醫(yī)藥價值，所以相繼有很多?？瘓蟮懒四蚣っ复制返奶崛》椒?，因人體尿液中尿激酶含量很低，取尿激酶的主要關(guān)鍵就是如何從大量的尿液中富集尿激酶，從目前發(fā)表的?？瘉砜?，主要有三類方法:(1)、發(fā)泡法:即以高速攪拌使酶液發(fā)泡，然后使泡沫液化，加入硫酸銨使尿激酶沉淀。(2 )、沉淀劑法:在尿液中加入沉淀劑，使尿激酶沉淀，尿激酶則保留在沉淀中，(3)、吸附劑，此法應(yīng)用最多，選擇適當(dāng)?shù)奈絼羞x擇的吸附尿激酶。本工藝就采用離子交換樹脂做吸附劑，生產(chǎn)尿激酶粗品。
[0006]隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活水平日益改善，社會對環(huán)境重視程度不斷提高，尿蛋白的收集越來越困難。按照目前男性尿蛋白制備通行的工藝:先收集尿液，再集中到加工點進行尿蛋白吸附和后續(xù)處理。該法收集男性尿液，氣味較大，不符合城市衛(wèi)生要求，生產(chǎn)尿蛋白粗品所需尿液，已從大中城市已經(jīng)全面退出，目前，收集的尿液主要來自小城鎮(zhèn)、鄉(xiāng)村，收集的成本越來越高，而且收集時間間隔也越來越長，尿蛋白的降解、變性較為嚴重，給后續(xù)的純化也帶來更多的困難。
[0007]國內(nèi)外也展開了大量了對尿激酶的分離研究工作。吉林大學(xué)生物化學(xué)教研室尿激酶組(吉林大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版1979年第二期)采用724離子交換樹脂作為尿激酶吸附劑，收率達到60-70% ;華東理工大學(xué)的周昕等(中國醫(yī)藥工業(yè)雜志199627 (6))研究了用大孔離子交換樹脂HD-2對尿激酶的吸附，吸附效率達到85% ;西北大學(xué)的董聿生等(高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報VOL.23N0.6)等采用了磁性高分子微球?qū)δ蚣っ傅奈?，活性回收率?0%?70%之間；張博達(專利號:CN91108119.4)采用高嶺土吸附尿激酶和集落刺激因子；鄭光會(專利號:CN91100702.4)采用氧化鋅和硫酸銅作為沉淀劑，沉淀人尿中的尿激酶。然而，上述方法均需要吸附材料在原尿中的長時間的浸泡、攪拌，因此采用這些方法也無法避免大量原尿的收集和運輸，因此不僅成本高，而且收集、運輸原料不方便。
[0008]CN88103076.7公開了一種采用堿處理的聚丙烯腈超濾膜濃縮原尿，使得尿激酶吸附在膜上，該方法能得到純度比較高的尿激酶，然而該膜的價格昂貴，而且在濃縮過程中需要加壓設(shè)備，大規(guī)模生產(chǎn)也難以實現(xiàn)，同時也無法避免大量原尿的收集和運輸問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的就是在符合城市衛(wèi)生化要求的基礎(chǔ)上，對尿液或稀釋尿液中尿激酶、尿胰蛋白酶抑制劑和人尿激肽原酶等尿蛋白進行現(xiàn)場吸附，解決了上述難題。
[0010]本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):一種制備尿激酶的方法，包括:
1)將濾布袋直接放置在衛(wèi)生間的便斗或者便池中；
2)尿液流經(jīng)濾布袋，尿蛋白被吸附；
3)收集吸附尿蛋白的濾布袋，運至加工點進行后續(xù)處理。
[0011]步驟I)所述的濾布袋，包括自外而內(nèi)依次設(shè)置的棉紗布層、改性纖維素層和改性硅膠層。
[0012]改性硅膠為苯基酰胺化官能團硅膠。
[0013]苯基酰胺化官能團硅膠通過以下方法制得:
1)硅膠在鹽酸溶液中浸泡后，洗滌至無氯離子，干燥；
2)將步驟(I)干燥后的硅膠于200-300°C中活化后，加入2-氯-6-甲基苯胺，苯基三氯硅烷回流反應(yīng)，過濾，沉淀洗滌、烘干得前驅(qū)體；
3)將前驅(qū)體和8.0mL吡啶溶解于70.6mL THF中，置于冰水浴中，控制溫度在0_5°C之間，向溶液中緩慢的加入10.0OOg, 74.4mmol 3-乙氧基丙稀酰氯，約15min滴完?；旌衔餃?zé)嶂?0°C并在該溫度下攪拌2h，然后再將三頸瓶置于冰水浴中(0-10°C )，加入lmol/L的鹽酸13.5mL，加入35mL水，減壓蒸餾使溶液濃縮成稠的於漿，冷卻至室溫，將於漿用33.0mL甲苯稀釋，并攪拌15min (溫度20-22°C )，然后將其置于冰水浴((TC )中攪拌lh。真空過濾收集固體，用70mL的水洗滌兩次，洗至中性，即得。
[0014]活化溫度優(yōu)選230°C，2-氯-6-甲基苯胺、一苯基三氯硅烷和干燥后的硅膠的用量比為(5-10)ml:(1-3) g:lg ;回流反應(yīng)時間為10-40h。
[0015]步驟3)收集吸附尿蛋白的濾布袋，運至加工點進行后續(xù)處理，包括以下步驟:
I)收集吸附尿蛋白的吸附劑，用pH6.0，0.lmol/L磷酸緩沖液400ml溶解，攪拌30分鐘，靜置倒出上清液，再用16% (w/v)硫酸銨400ml溶解，攪拌30分鐘，取上清。
[0016]2)再補加4.6g硫酸銨，攪拌溶解后，用IN的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.4，靜置2小時；
3)濾紙過濾收集沉淀，用生理鹽水洗滌一次，再用一定濃度的Η)ΤΑ溶液螯合Cu2+洗滌，
4)然后再向沉淀中加入一定量的氨水，使沉淀中的尿激酶充分解離，得尿激酶溶液。
[0017]5 )將尿激酶溶液置于冷凍干燥機。
[0018]測定活性為4.12X105 IU。
[0019]EDTA均為4.5mmol，5°C條件下輕輕攬摔15min。
[0020]本發(fā)明相對于最接近的現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點:
本發(fā)明提供的尿激酶快速吸附袋結(jié)構(gòu)簡單、使用方便，通過改性纖維素層和改性硅膠層聯(lián)合使用，制得的吸附袋能夠在衛(wèi)生間便池即時、快速吸附尿激酶，減少傳統(tǒng)方法中原尿收集、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)，大大簡化了尿激酶粗體的提取工序和工作量，方便、快速、大大節(jié)約了成本，易于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
[0021]利用特定尿蛋白的等電點性質(zhì)，通過使用包括離子交換樹脂等特