轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的一種引物組、一種 試劑盒和一種檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織發(fā)表的《2014年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè) 化發(fā)展態(tài)勢(shì)》報(bào)告顯示，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1. 815億公頃，比2013年增加了 600 萬(wàn)公頃，轉(zhuǎn)基因作物經(jīng)過(guò)19年的發(fā)展，種植面積增加了 100倍以上，已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)史上采 用最為迅速的作物技術(shù)。
[0003]轉(zhuǎn)基因大豆作為最重要的轉(zhuǎn)基因作物之一，目前已有27個(gè)事件在26個(gè)國(guó)家中被 批準(zhǔn)用于食物、飼料、環(huán)境釋放或者種植。其中美國(guó)國(guó)內(nèi)94%的大豆都是轉(zhuǎn)基因大豆，巴西 的種植面積達(dá)到了 91%。雖然我國(guó)還沒(méi)有批準(zhǔn)任何轉(zhuǎn)基因大豆品系進(jìn)行商業(yè)化種植，但我 國(guó)已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因大豆的使用與消費(fèi)大國(guó)，產(chǎn)品越來(lái)越多地進(jìn)入了我國(guó)的食品生產(chǎn)與消費(fèi) 鏈，2013年轉(zhuǎn)基因大豆的進(jìn)口總量已達(dá)到6000萬(wàn)噸。
[0004] 為了加強(qiáng)對(duì)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全管理，保障人體健康，規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的銷(xiāo)售 行為，引導(dǎo)和保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)，2002年中國(guó)農(nóng)業(yè)部頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦 法》，2006年通過(guò)了《中華人民共和國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》，明確規(guī)定在中國(guó)境內(nèi)銷(xiāo)售列入標(biāo) 識(shí)的轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品，必須進(jìn)行是否含有轉(zhuǎn)基因成分的標(biāo)識(shí)。因此，為保護(hù)我國(guó)消費(fèi)者 利益，解決貿(mào)易糾紛，必須建立一套快速、有效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。
[0005]近年來(lái)，孟山都公司的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因大豆M0N87701已陸續(xù)在美國(guó)、加拿大、日本、歐 盟、墨西哥等國(guó)家批準(zhǔn)用于商業(yè)化種植或食用。2013年，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)發(fā)放了孟山都遠(yuǎn)東有限 公司申請(qǐng)的抗蟲(chóng)大豆M0N87701可進(jìn)口用作加工原料的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(shū)。
[0006] 目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因大豆M0N87701的檢測(cè)方法主要集中在普通的定性 及定量PCR方法，這些方法都需要高端的儀器設(shè)備和專(zhuān)業(yè)的操作人員。本領(lǐng)域目前還沒(méi)有 檢測(cè)效果良好且操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低的特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N87701的方法。
[0007]LAMP技術(shù)是2000年日本榮研化學(xué)株式會(huì)社發(fā)明的一種體外恒溫核酸擴(kuò)增方法， 即所謂的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（Loop-MediatedIsothermalAmplification，簡(jiǎn)稱(chēng)LAMP) 技術(shù)。因其具有快速簡(jiǎn)便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，可以大量擴(kuò)增所需的靶序 列。該方法只需要極少的試劑費(fèi)用和一個(gè)水浴鍋即可完成絕大多數(shù)PCR檢測(cè)的過(guò)程，無(wú)論 是實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)還是現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)都可以準(zhǔn)確快速靈敏的完成，是真正普及型的核酸檢測(cè)方法。
[0008]但是，目前用于LAMP檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N87701的引物的敏感性和特異性仍然不 高，無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種用在環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的引物組，該引物組具有較高 的敏感性和特異性，能夠滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)的需要。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種引物組，該引物組包括外引物對(duì)、 內(nèi)引物對(duì)和環(huán)引物對(duì)；其中，所述外引物對(duì)包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物； 所述外引物對(duì)包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物；所述外引物對(duì)包括SEQID NO:3和SEQIDNO:4所示的引物；所述外引物對(duì)包括SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示 的引物。
[0011] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，該試劑盒至少包括如上所示的引物組和 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增試劑。
[0012] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N87701的方法，該方法至少包 括如下步驟：（1)提取待測(cè)大豆的基因組DNA作為待擴(kuò)增樣本；（2)使用如上所述的引物 組，以所述待擴(kuò)增樣本為模版，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的操作；（3)在環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò) 增的進(jìn)行過(guò)程中通過(guò)實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)是否具有S型擴(kuò)增曲線(xiàn)；和/或，在環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò) 增結(jié)束后，通過(guò)染色和/或電泳檢測(cè)擴(kuò)增后的物料中是否含有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；如果在環(huán) 介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的進(jìn)行過(guò)程中具有S型擴(kuò)增曲線(xiàn)，或，擴(kuò)增后的物料中含有特異性擴(kuò)增 產(chǎn)物，則指示待測(cè)大豆為轉(zhuǎn)基因大豆M0N87701。
[0013] 通過(guò)上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆 M0N87701實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、靈敏且準(zhǔn)確地檢測(cè)。
[0014] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0016] 圖1是實(shí)施例1中的4種引物組的擴(kuò)增相同樣本的擴(kuò)增曲線(xiàn)。
[0017] 圖2是實(shí)施例2中引物組1擴(kuò)增不同大豆樣本的實(shí)時(shí)擴(kuò)增圖。
[0018] 圖3是實(shí)施例3中引物組1對(duì)不同轉(zhuǎn)基因生物材料的實(shí)時(shí)擴(kuò)增圖。
[0019] 圖4是實(shí)施例4中引物組1擴(kuò)增不同大豆樣本的染色結(jié)果圖。
[0020] 圖5是實(shí)施例5中引物組1擴(kuò)增不同轉(zhuǎn)基因生物材料的染色結(jié)果圖。
[0021] 圖6是實(shí)施例6中引物組1擴(kuò)增不同大豆樣本的電泳結(jié)果圖。
[0022] 圖7是實(shí)施例6中引物組1擴(kuò)增不同轉(zhuǎn)基因生物材料的電泳結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描 述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0024] 一方面，本發(fā)明提供了一種引物組，該引物組包括外引物對(duì)、內(nèi)引物對(duì)和環(huán)引物 對(duì)；其中，所述外引物對(duì)包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物；所述外引物對(duì)包括 SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物；所述外引物對(duì)包括SEQIDNO:3和SEQIDNO: 4所示的引物；所述外引物對(duì)包括SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物。
[0025] 具體地，本發(fā)明的引物組如表1所示：
[0026]表1
[0027]
[0028] 本發(fā)明中，如上所述的引物可以通過(guò)常規(guī)的DNA合成方法進(jìn)行合成，可以通過(guò)商 業(yè)訂制的方式獲得上述引物。
[0029] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，該試劑盒至少包括如上所示的引物組和 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增試劑。
[0030] 其中，如上所述的試劑盒中，所述外引物對(duì)可以以8-12ymol/L的溶液的形 式存在，所述內(nèi)引物對(duì)可以以35-45ymol/L的溶液的形式存在，所述環(huán)引物對(duì)可以以 18-22ymol/L的溶液形式存在。
[0031] 其中，所述環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增試劑可以為常規(guī)的進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增所需 的試劑，所述環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增試劑可以包括擴(kuò)增緩沖液、dNTP和DNA聚合酶。其中，所 述dNTP是指dATP、dTTP、dCTP和dGTP的等量（摩爾）混合物。其中，所述DNA聚合酶可以 為常規(guī)的能夠進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的DNA聚合酶，例如BstDNA大片段聚合酶等。
[0032] 其中，所述擴(kuò)增緩沖液可以含有8-12mM的KCl、8-12mM的（NH4) 2S04、l-3mM的MgSO4 和0. 05-0. 2體積％的TritonX-IOO;且所述擴(kuò)增緩沖液的pH值可以為8. 6-9. 0,最優(yōu)選為 8. 8 〇
[0033] 其中，優(yōu)選地，所述環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增試劑還包括6-10mM的MgSOjP4-8mM的 甜菜堿。
[0034] 其中，為了方便以顯色的方式展示在環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增結(jié)束后的物料中是否含 有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，該試劑盒還含有顯色試劑，所述顯色試劑可以為熒光染料SYBRGreen Io
[0035] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆M0N87701的方法，該方法至少包 括如下步驟：（1)提取待測(cè)大豆的基因組DNA作為待擴(kuò)增樣本；（2)使用如上所述的引物 組，以所述待擴(kuò)增樣本為模版，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的操作；（3)在環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò) 增的進(jìn)行過(guò)程中通過(guò)實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)是否具有S型擴(kuò)增曲線(xiàn)；和/或，在環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò) 增結(jié)束后，通過(guò)染色和/或電泳檢測(cè)擴(kuò)增后的物料中是否含有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；如果在環(huán) 介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增的進(jìn)行過(guò)程中具有S型擴(kuò)增曲線(xiàn)，或，擴(kuò)增后的物料中含有特異性擴(kuò)增 產(chǎn)物，則指示待測(cè)大豆為轉(zhuǎn)基因大豆M0N87701。
[0036] 其中，相對(duì)于25yL的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系，以基因組DNA的量計(jì)，待擴(kuò) 增樣本的用量可以為25-50ng。
[0037] 其中，特別優(yōu)選地，本發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增可以以如下反應(yīng)體系進(jìn)行：恒 溫基因擴(kuò)增反應(yīng)體系為25yL，其中包括：F3/B3各0. 4yM、FIP/BIP各1.6yM、LF/BF各 0? 8yM、8mMMgSO4UXThermoPol緩沖液（包含：20mMTriS-HCUpH8. 8,25°C)，IOmM KCl,IOmM(NH4)2SO4, 2mMMgSO4, 0?I體積 ％TritonX-100)、6mM甜菜堿、I. 2mMdNTP、8U BstDNA大片段聚合酶，模版DNA溶液2yL。實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)需加入終濃度為IX的SYBRGreen I;顯色檢測(cè)需在PCR管蓋內(nèi)壁加1000X的SYBRGreenI溶液2yL，最后用雙蒸水補(bǔ)足至 25uL0
[0038] 其中，特別優(yōu)選地，本發(fā)明的檢測(cè)方法可以按照如下方式中的至少一種進(jìn)行結(jié)果 判定：（1)實(shí)時(shí)焚光法：將反應(yīng)管放置在ESE-Quanttubescanner中，設(shè)置反應(yīng)條件為： 63°C恒溫反應(yīng)60min，并在80°C反應(yīng)3min。反應(yīng)結(jié)束后觀察ESE-Quanttubescanner軟 件判斷擴(kuò)增結(jié)果，如果出現(xiàn)"S"型曲線(xiàn)則為陽(yáng)性，無(wú)"S"型曲線(xiàn)則為陰性；（2)顯色法：將擴(kuò) 增反應(yīng)后的物料與PCR管蓋上的熒光染料SYBRGreenI搖動(dòng)混勻，肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，若 顏色變?yōu)榫G色則說(shuō)明反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，若顏色仍為紅色說(shuō)明反應(yīng)為結(jié)果陰性；（3)電泳法： 將LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳圖為典型的LAMP階梯條狀說(shuō)明反應(yīng)結(jié) 果為陽(yáng)性，如果無(wú)特異性條帶為陰性。其中，如上所說(shuō)的陽(yáng)性表示待測(cè)大豆為轉(zhuǎn)基因大豆 M0N87701，如上所說(shuō)的陰性表示待測(cè)大豆不是轉(zhuǎn)基因大豆M0N87701。
[0039] 以下，通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明：
[0040] 制備實(shí)施例1
[0041] 按照文獻(xiàn)（趙麗娟等，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)》， 2014年，第2期）中的引物設(shè)計(jì)策略，設(shè)計(jì)如表2所示的引物，并通過(guò)寶生物公司進(jìn)行定制 合成。
[0042]表 2

[0045] 實(shí)施例I
[0046] 將非轉(zhuǎn)基因大豆（品系為黑農(nóng)60,購(gòu)自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)藥種子銷(xiāo)售中心， 以下相同）分別磨成干粉與轉(zhuǎn)基因大豆M0N87701(購(gòu)自AOCS公司，以下相同）的種子，然 后按照9:1的重量比混合，并且使用DNA提取試劑盒（購(gòu)自康為世紀(jì)公司，以下相同）按其 說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行DNA的提取，獲得DNA濃度為15ng/ y L的模板樣品。
[0047] 按照如下反應(yīng)體系，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫核酸